Межклеточная коммуникация является критически важной составляющей поддержания гомеостаза ткани. Одним из способов коммуникации является перенос широкого спектра биологически активных молекул – белков, нуклеиновых кислот (в первую очередь, некодирующих РНК) и липидов – в составе внеклеточных везикул (ВВ). Это позволяет клеткам-продуцентам ВВ изменять метаболическую и транскрипционную активность отдельных популяций клеток-мишеней в широком диапазоне и «настраивать» ее в соответствии с потребностями ткани. Большинство имеющихся работ сконцентрированы на изучении состава и функций секретируемых во внешнюю среду ВВ, тогда как изучение подкласса везикул, ассоциированного с мембраной (мембранно-ассоциированные везикулы, МАВ) затрудняется из-за отсутствия общепринятых методов их выделения из разных типов клеток, в том числе культивируемых, и характеристики. В данной работе мы приводим протокол, позволяющий выделять фракцию МАВ культивируемых мезенхимных стромальных/стволовых клеток с сохранением морфологии и жизнеспособности самих клеток с помощью обработки гиалуронидазой. Данный протокол показал наиболее высокую эффективность по сравнению с другими протестированными методами и позволяет получить фракцию, значимо обогащенную везикулами, что показано методами анализа траекторий наночастиц и просвечивающей электронной микроскопии. Проведенный сравнительный анализ характеристик МАВ и ВВ, секретируемых в среду, показал, что предлагаемый протокол выделения МАВ позволяет получить фракцию со сходной концентрацией частиц, однако они обладают меньшим размером по сравнению с ВВ. Таким образом описанный нами метод выделения позволяет получить фракцию МАВ для дальнейшего анализа их состава и функциональных особенностей.