vestnik-bio-msuВестник Московского университета. Серия 16. БиологияVestnik Moskovskogo universiteta. Seriya 16. Biologiya0137-0952Lomonosov Moscow State University, School of Biology10.55959/MSU0137-0952-16-80-3S-11vestnik-bio-msu-1544Research ArticleОригинальные исследованияОценка связывания ингибиторов PARP в режиме реального времени на основе Ni-NTA-агарозных шариковNi-NTA bead-based real-time monitoring of PARPs inhibitor bindingЛобановаА. А.LobanovaA. A.

Лобанова Ангелина Андреевна – инженер кафедры биоинженерии биологического факультета  

119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 

Тел.: 8-495-939-57-38 

1–12 Leninskie gory, Moscow, 119234 

angelina.lobanova@student.msu.ruСаулинаА. А.SaulinaO. V.

Саулина Александра Александровна – мл. науч. сотр. кафедры биоинженерии биологического факультета 

119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 

Тел.: 8-495-939-57-38 

 1–12 Leninskie gory, Moscow, 119234 

lys-alex-bio-msu@yandex.ruГераськинаО. В.GeraskinaO. V.

Гераськина Ольга Вячеславовна – науч. сотр.  

119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 34/5 

Тел.: 8-495-939-57-38 

 34/5 Vavilov Str., Moscow, 119334 

olgasamsonova@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8137-4685КошкинаД. О.KoshkinaD. O.

Кошкина Дарья Олеговна – мл. науч. сотр. кафедры биоинженерии биологического факультета 

119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 

Тел.: 8-495-939-57-38 

 1–12 Leninskie gory, Moscow, 119234 

koshkina.daria.2015@post.bio.msu.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4129-4984МалюченкоН. В.MaluchenkoN. V.

Малюченко Наталия Валериевна – канд. биол. наук, доц. кафедры биоинженерии биологического факультета 

119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 

Тел.: 8-495-939-57-38 

 1–12 Leninskie gory, Moscow, 119234 

mal_nat@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1596-9506ФеофановА. В.FeofanovA. V.

Феофанов Алексей Валерьевич – докт. биол. наук, проф кафедры биоинженерии биологического факультета 

119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 

119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 34/5 

Тел.: 8-495-938-22-91 

 1–12 Leninskie gory, Moscow, 119234 

 34/5 Vavilov Str., Moscow, 119334 

avfeofanov@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7389-7993СтудитскийВ. М.StuditskyV. M.

Студитский Василий Михайлович – докт. биол. наук, вед. науч. сотр. кафедры биоинженерии биологического факультета  

333 Cottman Ave., Philadelphia, 19111, Pennsylvania 

Тел.: 8-495-939-57-38 

 333 Cottman Ave., Philadelphia, 19111, Pennsylvania 

vasily.studitsky@fccc.eduБиологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. ЛомоносоваРоссияSchool of Biology, Lomonosov Moscow State UniversityRussian FederationИнститут биологии гена, Российская академия наукРоссияInstitute of Gene Biology, Russian Academy of SciencesRussian FederationБиологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Институт биологии гена, Российская академия наукРоссияSchool of Biology, Lomonosov Moscow State University; Institute of Gene Biology, Russian Academy of SciencesRussian FederationFox Chase Cancer CenterСоединённые Штаты АмерикиFox Chase Cancer CenterUnited States202510112025803S73–80Copyright © Лобанова А.А., Саулина А.А., Гераськина О.В., Кошкина Д.О., Малюченко Н.В., Феофанов А.В., Студитский В.М., 20252025Лобанова А.А., Саулина А.А., Гераськина О.В., Кошкина Д.О., Малюченко Н.В., Феофанов А.В., Студитский В.М.Lobanova A.A., Saulina O.V., Geraskina O.V., Koshkina D.O., Maluchenko N.V., Feofanov A.V., Studitsky V.M.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vestnik-bio-msu.elpub.ru/jour/article/view/1544

В исследовании была создана платформа для флуоресцентной микроскопии, которая позволяет в режиме реального времени визуализировать динамику взаимодействия лиганда с белками, помеченными His-tag, связывающимися с Ni2+ на NTA-агарозных шариках. Эта методология преодолевает критические ограничения традиционных методов, таких как поверхностный плазмонный резонанс или гель-электрофорез, за счет сохранения кинетики фазы раствора и обеспечения субминутного временного разрешения в физиологических буферах. Мы применили эту платформу для исследования действия ингибиторов в системе нуклеосом, которая является более физиологически подходящей моделью, чем свободная ДНК. Изучая взаимодействия PARP2 с нуклеосомами в присутствии и в отсутствие клинических ингибиторов (талазопариба и велипариба), а также реакцию поли(АДФ-рибозил)ирования в присутствии НАД+, мы смогли продемонстрировать прямое пространственное и временное разрешение динамики хроматин-белок. Практически неограниченная совместимость платформы с буферами, возможность мониторинга в режиме реального времени и устранение артефактов ковалентной иммобилизации обеспечивают новое понимание механизмов взаимодействия лекарственных средств и хроматина.

This study establishes a real-time fluorescence microscopy platform for visualizing ligand binding dynamics to His-tagged proteins bound to Ni-NTA agarose beads. By preserving solution-phase kinetics while enabling sub-minute temporal resolution in physiological buffers, the methodology overcomes critical limitations of surface-based techniques and gel electrophoretic methods. We applied this platform to investigate inhibitor action within a nucleosomal system, a more physiologically relevant context than free DNA. Through studies of PARP2-nucleosome interactions modulated by clinical inhibitors (talazoparib, veliparib) and by reaction of poly(ADP-ribosyl)ation in the presence of NAD+, we demonstrate direct spatial and temporal resolution of chromatin-protein dynamics. The platform’s virtually unlimited buffer compatibility, real-time monitoring capabilities, and elimination of covalent immobilization artifacts provide transformative insights into drug mechanisms and chromatin engagement processes.

Ni-NTA-агарозные шарикиPARP2ингибиторы PARPнуклеосомыNi-NTA-agarose beadsPARP2PARP inhibitorsnucleosomesРабота выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, проект № 21-64-00001-п.This work was supported by the Russian Science Foundation, project no. 21-64-00001-p.ReferencesLuger K., Hansen J.C. Nucleosome and chromatin fiber dynamics. Curr. Opin. Struct. Biol. 2005;15(2):188–196.Luger K., Hansen J.C. Nucleosome and chromatin fiber dynamics. Curr. Opin. Struct. Biol. 2005;15(2):188–196.Luger K., Dechassa M.L., Tremethick D.J. New insights into nucleosome and chromatin structure. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012;13(7):436–447.Luger K., Dechassa M.L., Tremethick D.J. New insights into nucleosome and chromatin structure. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012;13(7):436–447.Langelier M.F., Planck J.L., Roy S., Pascal J.M. Structural basis for DNA damage-dependent poly(ADP-ribosyl) ation by human PARP-1. Science. 2012;336(6082):728–732.Langelier M.F., Planck J.L., Roy S., Pascal J.M. Structural basis for DNA damage-dependent poly(ADP-ribosyl) ation by human PARP-1. Science. 2012;336(6082):728–732.Lakowicz J.R. Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd ed. N.Y.: Springer; 2006. 954 pp.Lakowicz J.R. Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd ed. N.Y.: Springer; 2006. 954 pp.Maluchenko N.V., Nilov D.K., Pushkarev S.V., Kotova E.Y., Gerasimova N.S., Kirpichnikov M.P., Langelier M.F., Pascal J.M., Akhtar M.S., Feofanov A.V., Studitsky V.M. Mechanisms of nucleosome reorganization by PARP1. Int. J. Mol. Sci. 2021;22(22):12127.Maluchenko N.V., Nilov D.K., Pushkarev S.V., Kotova E.Y., Gerasimova N.S., Kirpichnikov M.P., Langelier M.F., Pascal J.M., Akhtar M.S., Feofanov A.V., Studitsky V.M. Mechanisms of nucleosome reorganization by PARP1. Int. J. Mol. Sci. 2021;22(22):12127.Maluchenko N., Saulina A., Geraskina O., Kotova E., Korovina A., Armeev G., Kirpichnikov M., Feofanov A., Studitsky V. Poly(ADP-ribose)polymerase 2 is zinc-dependent enzyme and nucleosome reorganizer. Cell. Mol. Life Sci. 2025;82(1):267.Maluchenko N., Saulina A., Geraskina O., Kotova E., Korovina A., Armeev G., Kirpichnikov M., Feofanov A., Studitsky V. Poly(ADP-ribose)polymerase 2 is zinc-dependent enzyme and nucleosome reorganizer. Cell. Mol. Life Sci. 2025;82(1):267.Maluchenko N., Koshkina D., Korovina A., Studitsky V., Feofanov A. Interactions of PARP1 inhibitors with PARP1-nucleosome complexes. Cells. 2022;11(21):3343.Maluchenko N., Koshkina D., Korovina A., Studitsky V., Feofanov A. Interactions of PARP1 inhibitors with PARP1-nucleosome complexes. Cells. 2022;11(21):3343.Hellman L.M., Fried M.G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2007;2(8):1849–1861.Hellman L.M., Fried M.G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2007;2(8):1849–1861.Pascal J.M. The comings and goings of PARP-1 in response to DNA damage. DNA Repair (Amst). 2018;71:177–182.Pascal J.M. The comings and goings of PARP-1 in response to DNA damage. DNA Repair (Amst). 2018;71:177–182.Riccio AA, Cingolani G, Pascal JM. PARP-2 domain requirements for DNA damage-dependent activation and localization to sites of DNA damage. Nucleic Acids Res. 2016;44(4):1691–1702.Riccio AA, Cingolani G, Pascal JM. PARP-2 domain requirements for DNA damage-dependent activation and localization to sites of DNA damage. Nucleic Acids Res. 2016;44(4):1691–1702.Murai J., Huang S.Y., Das B.B., Renaud A., Zhang Y., Doroshow J.H., Ji J., Takeda S., Pommier Y. Trapping of PARP1 and PARP2 by clinical PARP inhibitors. Cancer Res. 2012;72(21):5588–5599.Murai J., Huang S.Y., Das B.B., Renaud A., Zhang Y., Doroshow J.H., Ji J., Takeda S., Pommier Y. Trapping of PARP1 and PARP2 by clinical PARP inhibitors. Cancer Res. 2012;72(21):5588–5599.Krüger A., Bürkle A., Hauser K., Mangerich A. Real-time monitoring of PARP1-dependent PARylation by ATR-FTIR spectroscopy. Nat. Commun. 2020;11(1):2174.Krüger A., Bürkle A., Hauser K., Mangerich A. Real-time monitoring of PARP1-dependent PARylation by ATR-FTIR spectroscopy. Nat. Commun. 2020;11(1):2174.Kurgina T.A., Anarbaev R.O., Sukhanova M.V., Lavrik O.I. A rapid fluorescent method for the real-time measurement of poly(ADP-ribose) polymerase 1 activity. Anal. Biochem. 2018;545:91–97.Kurgina T.A., Anarbaev R.O., Sukhanova M.V., Lavrik O.I. A rapid fluorescent method for the real-time measurement of poly(ADP-ribose) polymerase 1 activity. Anal. Biochem. 2018;545:91–97.Langelier M.F., Riccio A.A., Pascal J.M. PARP-2 and PARP-3 are selectively activated by 5′ phosphorylated DNA breaks through an allosteric regulatory mechanism shared with PARP-1. Nucleic Acids Res. 2014;42(12):7762–7775.Langelier M.F., Riccio A.A., Pascal J.M. PARP-2 and PARP-3 are selectively activated by 5′ phosphorylated DNA breaks through an allosteric regulatory mechanism shared with PARP-1. Nucleic Acids Res. 2014;42(12):7762–7775.Luger K., Mäder A.W., Richmond R.K., Sargent D.F., Richmond T.J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 1997;389(6648):251–260.Luger K., Mäder A.W., Richmond R.K., Sargent D.F., Richmond T.J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 1997;389(6648):251–260.Richmond T.J., Davey C.A. The structure of DNA in the nucleosome core. Nature. 2003;423(6936):145–150.Richmond T.J., Davey C.A. The structure of DNA in the nucleosome core. Nature. 2003;423(6936):145–150.Luger K., Rechsteiner T.J., Richmond T.J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Chromatin. Methods in Enzymology, vol. 304. Eds. P.M. Wassarman and A.P. Wolffe. Academic Press; 1999:3–19.Luger K., Rechsteiner T.J., Richmond T.J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Chromatin. Methods in Enzymology, vol. 304. Eds. P.M. Wassarman and A.P. Wolffe. Academic Press; 1999:3–19.Wasserberg D., Cabanas-Danés J., Prangsma J., O’Mahony S., Cazade P.A., Tromp E., Blum C., Thompson D., Huskens J., Subramaniam V., Jonkheijm P. Controlling protein surface orientation by strategic placement of His-tags. ACS Nano. 2017;11(9):9350–9361.Wasserberg D., Cabanas-Danés J., Prangsma J., O’Mahony S., Cazade P.A., Tromp E., Blum C., Thompson D., Huskens J., Subramaniam V., Jonkheijm P. Controlling protein surface orientation by strategic placement of His-tags. ACS Nano. 2017;11(9):9350–9361.Wu C.C., Reinhoudt D.N., Otto C., Velders A.H., Subramaniam V. Protein immobilization on Ni(II) ion patterns prepared by microcontact printing and dip-pen nanolithography. ACS Nano. 2010;4(2):1083–1091.Wu C.C., Reinhoudt D.N., Otto C., Velders A.H., Subramaniam V. Protein immobilization on Ni(II) ion patterns prepared by microcontact printing and dip-pen nanolithography. ACS Nano. 2010;4(2):1083–1091.Castro-Hinojosa C., Del Sol-Fernández S., Moreno-Antolín E., Martín-Gracia B., Ovejero J.G., de la Fuente J.M., Grazú V., Fratila R.M., Moros M. A simple and versatile strategy for oriented immobilization of Histagged proteins on magnetic nanoparticles. Bioconjug. Chem. 2023;34(12):2275–2292.Castro-Hinojosa C., Del Sol-Fernández S., Moreno-Antolín E., Martín-Gracia B., Ovejero J.G., de la Fuente J.M., Grazú V., Fratila R.M., Moros M. A simple and versatile strategy for oriented immobilization of Histagged proteins on magnetic nanoparticles. Bioconjug. Chem. 2023;34(12):2275–2292.Zandarashvili L., Langelier M.F., Velagapudi U.K., Hancock M.A., Steffen J.D., Billur R., Hannan Z.M., Wicks A.J., Krastev D.B., Pettitt S.J., Lord C.J., Talele T.T., Pascal J.M., Black B.E. Structural basis for allosteric PARP-1 retention on DNA breaks. Science. 2020;368(6486):eaax6367.Zandarashvili L., Langelier M.F., Velagapudi U.K., Hancock M.A., Steffen J.D., Billur R., Hannan Z.M., Wicks A.J., Krastev D.B., Pettitt S.J., Lord C.J., Talele T.T., Pascal J.M., Black B.E. Structural basis for allosteric PARP-1 retention on DNA breaks. Science. 2020;368(6486):eaax6367.Lobanova A.A., Korovina A.N., Koshkina D.O., Chernikova P.A., Feofanov A.V., Studitsky V.M., Nilov D.K., Maluchenko N.V. Gel electrophoresis as a method for classifying inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerases 1 and 2. Mosc. Univ. Biol. Sci. Bull. 2024;79(4):239–245.Lobanova A.A., Korovina A.N., Koshkina D.O., Chernikova P.A., Feofanov A.V., Studitsky V.M., Nilov D.K., Maluchenko N.V. Gel electrophoresis as a method for classifying inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerases 1 and 2. Mosc. Univ. Biol. Sci. Bull. 2024;79(4):239–245.Langelier M.F., Steffen J.D., Riccio A.A., McCauley M., Pascal J.M. Purification of DNA damage-dependent PARPs from E. coli for structural and biochemical analysis. Poly(ADP-Ribose) Polymerase. Methods in Molecular Biology, vol 1608. N.Y.: Humana Press; 2017:431–444.Langelier M.F., Steffen J.D., Riccio A.A., McCauley M., Pascal J.M. Purification of DNA damage-dependent PARPs from E. coli for structural and biochemical analysis. Poly(ADP-Ribose) Polymerase. Methods in Molecular Biology, vol 1608. N.Y.: Humana Press; 2017:431–444.Koshkina D., Maluchenko N., Nilov D., Lyubitelev A., Korovina A., Pushkarev S., Armeev G., Kirpichnikov M., Studitsky V., Feofanov A. Non-classical H1-like PARP1 binding to chromatosome. Cells. 2025;14(17):1309.Koshkina D., Maluchenko N., Nilov D., Lyubitelev A., Korovina A., Pushkarev S., Armeev G., Kirpichnikov M., Studitsky V., Feofanov A. Non-classical H1-like PARP1 binding to chromatosome. Cells. 2025;14(17):1309.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.