vestnik-bio-msuВестник Московского университета. Серия 16. БиологияVestnik Moskovskogo universiteta. Seriya 16. Biologiya0137-0952Lomonosov Moscow State University, School of Biologyvestnik-bio-msu-294Research ArticleИммунологияImmunologyПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ГЛИКОПРОТЕИНА ВИРУСА ЭБОЛЫDEVELOPMENT AND CHARACTERIZATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO EBOLA VIRUS GLYCOPROTEINШемчуковаО. Б.SchemchukovaO. B.

канд. биол. наук, ст. науч. сотр. Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения. Тел.: 8-499-613-23-65

rcmdt404@yandex.ruДементьеваИ. Г.Dement’yevaI. G.

ст. науч. сотр. Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения. Тел.: 8-499-613-23-65

irina.dementieva@mail.ruВарламовН. Е.VarlamovN. E.

вет. врач Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения. Тел.: 8-499-613-23-65

rcmdt404@ya.ruПоздняковаЛ. П.PozdnyakovaL. P.

науч. сотр. Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения. Тел.: 8-499-613-23-65

plp1810@inbox.ruБоковМ. Н.BokovM. N.

науч. сотр. Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения. Тел.: 8-499-613-23-65

schpundic@gmail.ruАлиевТ. К.AlievT. K.

науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ. Тел.: 8-495-330-66-38

ta12345@list.ruПанинаА. А.PaninaA. A.

науч. сотр. Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Тел.: 8-495-330-66-38

panina@ibch.ruДолгихД. А.DolgikhD. A.

докт. биол. наук, проф. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-336-80-11

dolgikh@nmr.ruКирпичниковМ. П.KirpichnikovM. P.

академик РАН, проф., докт. биол. наук, декан, зав. кафедрой биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-27-76

kirpichnikov@inbox.ruСвешниковП. Г.SveshnikovP. G.

докт. биол. наук, проф., генеральный директор Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения. Тел.: 8-499-613-23-65

petersveshnikov@list.ruВсероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения; Россия, 117638, Москва, Симферопольский бульвар, д. 8РоссияRussian Research Center for Molecular Diagnostics and Therapy, Simferopol Bulvar 8, Moscow, 117638, RussiaRussian Federationкафедра химической энзимологии, химический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3РоссияDepartment of Chemical Enzymology, School of Chemistry, M.V. Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1–3, Moscow, 119234, RussiaRussian FederationИнститут биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Россия, 117997, г. Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10РоссияShemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Miklukho-Maklaya ul. 16/10, GSP-7, Moscow, 117997, RussiaRussian Federationкафедра биоинженерии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12РоссияDepartment of Bioengineering, School of Biology, M.V. Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1-12, Moscow, 119234, RussiaRussian Federation201614032016012934Copyright © Шемчукова О.Б., Дементьева И.Г., Варламов Н.Е., Позднякова Л.П., Боков М.Н., Алиев Т.К., Панина А.А., Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Свешников П.Г., 20162016Шемчукова О.Б., Дементьева И.Г., Варламов Н.Е., Позднякова Л.П., Боков М.Н., Алиев Т.К., Панина А.А., Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Свешников П.Г.Schemchukova O.B., Dement’yeva I.G., Varlamov N.E., Pozdnyakova L.P., Bokov M.N., Aliev T.K., Panina A.A., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P., Sveshnikov P.G.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vestnik-bio-msu.elpub.ru/jour/article/view/294

Проведена иммунизация мышей BALB/с рекомбинантным гликопротеином вируса Эбола. В результате селекции и клонирования мышиных гибридом получено пять генетически стабильных клонов моноклональных антител GPE118 (IgG), GPE274 (IgM), GPE325 (IgM), GPE463 (IgM) и GPE534 (IgG). Проведены выделение и очистка указанных антител из асцитной жидкости мышей линии BALB/с с использованием аффинной хроматографии на сорбенте белок G-сефарозе (для IgG) и методом преципитации эуглобулинов (для IgM). Проведен иммунохимический анализ эпитопной специфичности выделенных антител с целью отбора не менее трех из них в качестве компонентов комбинированного терапевтического средства для профилактики и лечения геморрагической лихорадки. Из данных иммуноблоттинга и сэндвич-ИФА следует, что эпитоп, узнаваемый GPE 534, отличается от эпитопов, узнаваемых моноклональными антителами GPE 118 и GPE 325. Последние два антитела также различаются по эпитопной специфичности, о чем свидетельствуют данные иммуноблоттинга и характер взаимодействия указанных антител с интактным и окисленным (частично дегликозилированным) рекомбинантным гликопротеином. Для исследования биологической активности и разработки на их основе рекомбинантных продуктов выбраны три кандидатных высокоаффинных моноклональных антитела — GPE 534, GPE 118 и GPE 325.

BALB/с mice were immunized with recombinant Ebola virus glycoprotein. Following selection, screening and cloning of murine hybridomas we obtained 5 genetically stable clones of monoclonal antibodies GPE118 (IgG), GPE274 (IgM), GPE325 (IgM), GPE463 (IgM), and GPE534 (IgG). These antibodies were isolated and purified from ascitic fluid of BALB/с mice using Protein G affinity chromatography (IgG) and euglobulin precipitation method (IgM). For the selection of at least 3 candidate antibodies to be tested in biological assays as components of an antibody cocktail for the prophylaxis and treatment of hemorrhagic fever, we carried out an immunochemical analysis of epitope specificity of isolated antibodies. Based on immunoblotting and sandwich ELISA data, it became evident that the epitope recognized by GPE 534 is different from GPE 118 and GPE 325 epitopes. The latter two antibodies also have different epitope specificity. It is evidenced from immunoblotting data as well as from binding data of these antibodies with intact and oxidized (partly deglycosylated) recombinant glycoprotein. For the studies of biological activity and the development of recombinant counterparts, we isolated 3 candidate high-affinity monoclonal antibodies GPE 534, GPE 118, and GPE 325.

вирус Эболагликопротеин вируса Эболагибридомамоноклональные антителамыши линии BALB/снепрямой ИФАсэндвич-ИФАиммуноблоттингEbola virusEbola virus glycoproteinhybridomamonoclonal antibodiesBALB/с miceindirect ELISAsandwich ELISAimmunoblotReferencesBaize S., Pannetier D., Oestereich L. et al. Emergence of Zaire Ebola virus disease in Guinea // N. Engl. J. Med. 2014. Vol. 371. N 15. P. 1418–1425.Baize S., Pannetier D., Oestereich L. et al. Emergence of Zaire Ebola virus disease in Guinea // N. Engl. J. Med. 2014. Vol. 371. N 15. P. 1418–1425.Geisbert T.W., Young H.A., Jahrling P.B., Davis K.J., Kagan E., Hensley L.E. Mechanisms underlying coagulation abnormalities in ebola hemorrhagic fever: overexpression of tissue factor in primate monocytes/macrophages is a key event // J. Infect. Dis. 2003. Vol. 188. N 11. P. 1618–1629.Geisbert T.W., Young H.A., Jahrling P.B., Davis K.J., Kagan E., Hensley L.E. Mechanisms underlying coagulation abnormalities in ebola hemorrhagic fever: overexpression of tissue factor in primate monocytes/macrophages is a key event // J. Infect. Dis. 2003. Vol. 188. N 11. P. 1618–1629.Geisbert T.W., Hensley L.E., Jahrling P.B., Larsen T., Geisbert J.B., Paragas J., Young H.A., Fredeking T.M., Rote W.E., Vlasuk G.P. Treatment of Ebola virus infection with a recombinant inhibitor of factor VIIa/tissue factor: a study in rhesus monkeys // Lancet. 2003. Vol. 362. N 9400. P. 1953–1958.Geisbert T.W., Hensley L.E., Jahrling P.B., Larsen T., Geisbert J.B., Paragas J., Young H.A., Fredeking T.M., Rote W.E., Vlasuk G.P. Treatment of Ebola virus infection with a recombinant inhibitor of factor VIIa/tissue factor: a study in rhesus monkeys // Lancet. 2003. Vol. 362. N 9400. P. 1953–1958.Warren T.K., Warfield K.L., Wells J., Swenson D.L., Donner K.S., Van Tongeren S.A., Garza N.L., Dong L., Mourich D.V., Crumley S., Nichols D.K., Iversen P.L., Bavari S. Advanced antisense therapies for postexposure protection against lethal filovirus infections // Nat. Med. 2010. Vol. 16. N 9. P. 991–994.Warren T.K., Warfield K.L., Wells J., Swenson D.L., Donner K.S., Van Tongeren S.A., Garza N.L., Dong L., Mourich D.V., Crumley S., Nichols D.K., Iversen P.L., Bavari S. Advanced antisense therapies for postexposure protection against lethal filovirus infections // Nat. Med. 2010. Vol. 16. N 9. P. 991–994.Volchkov V.E., Feldmann H., Volchkova V.A., Klenk H.D. Processing of the Ebola virus glycoprotein by the proprotein convertase furin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. N 10. P. 5762–5767.Volchkov V.E., Feldmann H., Volchkova V.A., Klenk H.D. Processing of the Ebola virus glycoprotein by the proprotein convertase furin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. N 10. P. 5762–5767.Lee J.E, Saphire E.O. Ebolavirus glycoprotein structure and mechanism of entry // Future Virol. 2009. Vol. 4. N 6. P. 621–635.Lee J.E, Saphire E.O. Ebolavirus glycoprotein structure and mechanism of entry // Future Virol. 2009. Vol. 4. N 6. P. 621–635.Jahrling P.B., Geisbert J.B., Swearengen J.R., Larsen T., Geisbert T.W. Ebola hemorrhagic fever: evaluation of passive immunotherapy in nonhuman primates // J. Infect. Dis. 2007. Vol. 196. Suppl. 2. P. S400–S403.Jahrling P.B., Geisbert J.B., Swearengen J.R., Larsen T., Geisbert T.W. Ebola hemorrhagic fever: evaluation of passive immunotherapy in nonhuman primates // J. Infect. Dis. 2007. Vol. 196. Suppl. 2. P. S400–S403.Parren P.W., Geisbert T.W., Maruyama T., Jahrling P.B., Burton D.R. Pre- and postexposure prophylaxis of Ebola virus infection in an animal model by passive transfer of a neutralizing human antibody // J. Virol. 2002. Vol. 76. N 12. P. 6408–6412Parren P.W., Geisbert T.W., Maruyama T., Jahrling P.B., Burton D.R. Pre- and postexposure prophylaxis of Ebola virus infection in an animal model by passive transfer of a neutralizing human antibody // J. Virol. 2002. Vol. 76. N 12. P. 6408–6412Oswald W.B., Geisbert T.W., Davis K.J., Geisbert J.B., Sullivan N.J., Jahrling P.B., Parren P.W., Burton D.R. Neutralizing antibody fails to impact the course of Ebola virus infection in monkeys // PLoS Pathog. 2007. Vol. 3. N 1. e9.Oswald W.B., Geisbert T.W., Davis K.J., Geisbert J.B., Sullivan N.J., Jahrling P.B., Parren P.W., Burton D.R. Neutralizing antibody fails to impact the course of Ebola virus infection in monkeys // PLoS Pathog. 2007. Vol. 3. N 1. e9.Olinger G.G., Pettitt J., Kim D. et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. Vol. 109. N 44. P. 18030–18035.Olinger G.G., Pettitt J., Kim D. et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. Vol. 109. N 44. P. 18030–18035.Qiu X., Audet J., Wong G. et al. Successful treatment of Ebola virus-infected cynomolgus macaques with monoclonal antibodies // Sci. Transl. Med. 2012. Vol. 4. N 138. P. 138–181.Qiu X., Audet J., Wong G. et al. Successful treatment of Ebola virus-infected cynomolgus macaques with monoclonal antibodies // Sci. Transl. Med. 2012. Vol. 4. N 138. P. 138–181.Qiu X., Wong G., Audet J. et al. Reversion of advanced Ebola virus disease in nonhuman primates with Zmapp // Nature. 2014. Vol. 514. N 7520. P. 47–53.Qiu X., Wong G., Audet J. et al. Reversion of advanced Ebola virus disease in nonhuman primates with Zmapp // Nature. 2014. Vol. 514. N 7520. P. 47–53.Sveshnikov P., Kiselev V. Methods, kits and compositions for the development and use of monoclonal antibodies specific to antigens of low immunogenicity. PCT/RU2004/ 000373, Filing date : 24.09.2004.Sveshnikov P., Kiselev V. Methods, kits and compositions for the development and use of monoclonal antibodies specific to antigens of low immunogenicity. PCT/RU2004/ 000373, Filing date : 24.09.2004.Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature. 1975. Vol. 256. N 5517. P. 495–497.Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature. 1975. Vol. 256. N 5517. P. 495–497.García-González M., Bettinger S., Ott S., Olivier P., Kadouche J., Pouletty P. Purification of murine IgG3 and IgM monoclonal antibodies by euglobulin precipitation // J. Immunol. Methods. 1988. Vol. 111. N 1. P. 17–23.García-González M., Bettinger S., Ott S., Olivier P., Kadouche J., Pouletty P. Purification of murine IgG3 and IgM monoclonal antibodies by euglobulin precipitation // J. Immunol. Methods. 1988. Vol. 111. N 1. P. 17–23.Westwood J, Thomas P. Studies on the structure and immunological activity of carcinoembryonic antigen — the role of disulphide bonds // Br. J. Cancer. 1975. Vol. 32. N 6. P. 708.Westwood J, Thomas P. Studies on the structure and immunological activity of carcinoembryonic antigen — the role of disulphide bonds // Br. J. Cancer. 1975. Vol. 32. N 6. P. 708.Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation // J. Histochem. Cytochem. 1974. Vol. 22. N 12. P. 1084–1091.Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation // J. Histochem. Cytochem. 1974. Vol. 22. N 12. P. 1084–1091.Ponomarenko J., Vaughan K., Sette A., Maurer-Stroh S. Conservancy of mAb epitopes in Ebolavirus glycoproteins of previous and 2014 outbreaks // PloS Curr. 2014. Vol. 6.Ponomarenko J., Vaughan K., Sette A., Maurer-Stroh S. Conservancy of mAb epitopes in Ebolavirus glycoproteins of previous and 2014 outbreaks // PloS Curr. 2014. Vol. 6.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.