vestnik-bio-msuВестник Московского университета. Серия 16. БиологияVestnik Moskovskogo universiteta. Seriya 16. Biologiya0137-0952Lomonosov Moscow State University, School of Biologyvestnik-bio-msu-325Research ArticleМетодыMethodsЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ УСТАНОВКА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ОДИНОЧНЫХ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НУКЛЕОСОМ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ ПОЛНОГО ВНУТРЕННЕГО ОТРАЖЕНИЯEXPERIMENTAL SETUP FOR STUDY OF IMMOBILIZED SINGLE NUCLEOSOMES USING TOTAL INTERNAL REFLECTION FLUORESCENCE MICROSCOPYКудряшоваК. С.KudryashovaK. S.

мл. науч. сотр. ИБХ РАН, вед. инженер кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-336-64-55

rekamoskva@mail.ruЧертковО. В.ChertkovO. V.

вед. инженер кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-938-22-91

o_chertkov@mail.ruИвановЯ. О.IvanovY. O.

студент кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-336-64-55

dopellgunger@gmail.comСтудитскийВ. М.StuditskyV. M.

докт. биол. наук, гл. науч. сотр. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ; руководитель лаборатории эпигенетики рака Центра исследований рака Фокс Чейз (Филадельфия, США). Тел.: 8-495-938-22-91

vasily.studitsky@fccc.eduФеофановА. В.FeofanovA. V.

докт. биол. наук, руководитель лаборатории оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул ИБХ РАН, проф. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-336-64-55

avfeofanov@yandex.ruКафедра биоинженерии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва; Россия, 117997, г. Москва, улица Миклухо-Маклая, дом 16/10РоссияBioengineering Department, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1-12, Moscow, 119234, Russia Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Miklukho-Maklaya ul. 16/10, GSP-7, 117997, Moscow, RussiaRussian FederationКафедра биоинженерии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12РоссияBioengineering Department, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1-12, Moscow, 119234, RussiaRussian FederationКафедра биоинженерии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 лаборатория эпигенетики рака, Центр исследований рака Фокс Чейз; США, штат Пенсильвания, 19111, г. Филадельфия, просп. Коттмана, д. 333РоссияBioengineering Department, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1-12, Moscow, 119234, Russia Cancer Epigenetics Program Team, Fox Chase Cancer Center; Cottman Avenue 333, Philadelphia, PA 19111, USARussian Federation201623052016023742Copyright © Кудряшова К.С., Чертков О.В., Иванов Я.О., Студитский В.М., Феофанов А.В., 20162016Кудряшова К.С., Чертков О.В., Иванов Я.О., Студитский В.М., Феофанов А.В.Kudryashova K.S., Chertkov O.V., Ivanov Y.O., Studitsky V.M., Feofanov A.V.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vestnik-bio-msu.elpub.ru/jour/article/view/325

Создана экспериментальная установка для изучения иммобилизованных молекул и их комплексов in vitro методом флуоресцентной микроскопии с чувствительностью на уровне одиночных флуорофоров. Установка регистрирует флуоресцентные изображения иммобилизованных молекул одновременно в двух спектральных диапазонах, обеспечивая анализ на основе эффекта Фёрстеровского резонансного переноса энергии. Возбуждение флуоресценции поверхностной световой волной, сформированной методом полного внутреннего отражения, и регистрация сигнала с помощью высокочувствительной системы детекции позволяют проводить измерения с временным разрешением около 100 мс. Разработан протокол модификации поверхности стекол для иммобилизации нуклеосом через высокоаффинные стрептавидин-биотиновые взаимодействия. Чтобы обеспечить иммобилизацию, один из концов ДНК флуоресцентно-меченых мононуклеосом был биотинилирован. Разработан алгоритм обработки изображений для анализа структурных перестроек в одиночных нуклеосомах. Флуоресцентная микроскопия одиночных иммобилизованных молекул и их комплексов расширяет возможности изучения структурной динамики нуклеосом при транскрипции и взаимодействии с различными ядерными белками.

An experimental setup for study of imm obilized molecules and their complexes by fluorescence microscopy with sensitivity at the single fluorophore level was developed. The installation records fluorescence images of immobilized molecules in two spectral ranges simultaneously, allowing analysis based on the Förster resonance energy transfer effect. The fluorescence excitation is caused by evanescent light wave formed by the total internal reflection technique, and registration of signal with a highly sensitive detection system allows conducting measurements with a temporal resolution of about 100 ms. The glass surface modification protocol was developed for immobilization of nucleosomes via the high-affinity streptavidin-biotin interactions. To ensure immobilization, one of the DNA ends of fluorescently labelled nucleosomal DNA was biotinylated. The algorithm of image processing for analysis of structural rearrangements in single nucleosomes was developed. Fluorescence microscopy of single immobilized molecules and their complexes allows the analysis of nucleosome structural dynamics during transcription and its interaction with various nuclear proteins.

нуклеосомахроматиниммобилизацияфлуоресценциямикроскопияодиночная молекула.nucleosomechromotineimmobilizationfluorescencemicroscopysingle moleculeReferencesSustarsic M., Kapanidis A.N. Taking the ruler to the jungle: single-molecule FRET for understanding biomolecular structure and dynamics in live cells // Curr. Opin. Struct. Biol. 2015. Vol. 34. P. 52–59.Sustarsic M., Kapanidis A.N. Taking the ruler to the jungle: single-molecule FRET for understanding biomolecular structure and dynamics in live cells // Curr. Opin. Struct. Biol. 2015. Vol. 34. P. 52–59.Juette M.F., Terry D.S., Wasserman M.R., Zhou Z., Altman R.B., Zheng Q., Blanchard S.C. The bright future of single-molecule fluorescence imaging // Curr. Opin. Chem. Biol. 2014. Vol. 20. P. 103–111.Juette M.F., Terry D.S., Wasserman M.R., Zhou Z., Altman R.B., Zheng Q., Blanchard S.C. The bright future of single-molecule fluorescence imaging // Curr. Opin. Chem. Biol. 2014. Vol. 20. P. 103–111.Luo Y., North J.A., Poirier M.G. Single molecule fluorescence methodologies for investigating transcription factor binding kinetics to nucleosomes and DNA // Methods. 2014. Vol.70. N 2–3. P. 108–118.Luo Y., North J.A., Poirier M.G. Single molecule fluorescence methodologies for investigating transcription factor binding kinetics to nucleosomes and DNA // Methods. 2014. Vol.70. N 2–3. P. 108–118.Ngo T.T., Ha T. Nucleosomes undergo slow spontaneous gaping // Nucleic Acids Res. 2015. Vol. 43. N 8. P. 3964–3971.Ngo T.T., Ha T. Nucleosomes undergo slow spontaneous gaping // Nucleic Acids Res. 2015. Vol. 43. N 8. P. 3964–3971.Ngo T.T., Zhang Q., Zhou R., Yodh J.G., Ha T. Asymmetric unwrapping of nucleosomes under tension directed by DNA local flexibility // Cell. 2015. Vol. 160. N 6. P. 1135–1144.Ngo T.T., Zhang Q., Zhou R., Yodh J.G., Ha T. Asymmetric unwrapping of nucleosomes under tension directed by DNA local flexibility // Cell. 2015. Vol. 160. N 6. P. 1135–1144.Kudryashova K.S., Chertkov O.V., Nikitin D.V., Pestov N.A., Kulaeva O.I., Efremenko A.V., Solonin A.S., Kirpichnikov M.P., Studitsky V.M., Feofanov A.V. Preparation of mononucleosomal templates for analysis of transcription with RNA polymerase using spFRET // Methods Mol. Biol. 2015. Vol. 1288. P. 395–412.Kudryashova K.S., Chertkov O.V., Nikitin D.V., Pestov N.A., Kulaeva O.I., Efremenko A.V., Solonin A.S., Kirpichnikov M.P., Studitsky V.M., Feofanov A.V. Preparation of mononucleosomal templates for analysis of transcription with RNA polymerase using spFRET // Methods Mol. Biol. 2015. Vol. 1288. P. 395–412.Feofanov A.V., Kudryashova K.S., Chertkov O.V., Nikitin D.V., Pestov N.A., Kulaeva O.I., Studitsky V.M., Kirpichnikov M.P. Analysis of nucleosome transcription using singleparticle FRET // Springer Proc. Phys. 2015. Vol. 164. P. 255–260.Feofanov A.V., Kudryashova K.S., Chertkov O.V., Nikitin D.V., Pestov N.A., Kulaeva O.I., Studitsky V.M., Kirpichnikov M.P. Analysis of nucleosome transcription using singleparticle FRET // Springer Proc. Phys. 2015. Vol. 164. P. 255–260.Kudryashova K.S., Nikitin D.V., Chertkov O.V., Gerasimova N.S.,Valieva M.E., Studitsky V.M., Feofanov A.V. Development of fluorescently labeled mononucleosomes for the investigation of transcription mechanisms by single complex microscopy // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2015. Vol. 70. N 4. P. 189–193.Kudryashova K.S., Nikitin D.V., Chertkov O.V., Gerasimova N.S.,Valieva M.E., Studitsky V.M., Feofanov A.V. Development of fluorescently labeled mononucleosomes for the investigation of transcription mechanisms by single complex microscopy // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2015. Vol. 70. N 4. P. 189–193.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.