vestnik-bio-msuВестник Московского университета. Серия 16. БиологияVestnik Moskovskogo universiteta. Seriya 16. Biologiya0137-0952Lomonosov Moscow State University, School of Biologyvestnik-bio-msu-327Research ArticleМетодыMethodsИЗМЕНЕНИЕ КОНФОРМАЦИИ ЛИНКЕРНОЙ ДНК ПРИ СВЯЗЫВАНИИ ГИСТОНА Н1.5 C НУКЛЕОСОМОЙ: ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ ОДИНОЧНЫХ КОМПЛЕКСОВCHANGE IN CONFORMATION OF LINKER DNA UPON BINDING OF HISTONE H1.5 TO NUCLEOSOME: FLUORESCENT MICROSCOPY OF SINGLE COMPLEXESЛюбителевА. В.LyubitelevA. V.

аспирант кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-938-22-91

varanus-salvator@yandex.ruКудряшоваК. С.KudryashovaK. S.

канд. биол. наук, мл. науч. сотр. ИБХ РАН, вед. инженер кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-336-64-55

rekamoskva@mail.ruМихайловаМ. С.MikhaylovaM. S.

студент кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-938-22-91

mashkuna@yandex.ruМалюченкоН. В.MalyuchenkoN. V.

канд. биол. наук, доцент кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-938-00-05

mal_nat@mail.ruЧертковО. В.ChertkovO. V.

вед. инженер кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-938-22-91

o_chertkov@mail.ruСтудитскийВ. М.StuditskyV. M.

докт. биол. наук, гл. науч. сотр. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ; руководитель лаборатории эпигенетики рака Центра исследований рака Фокс Чейз (Филадельфия, США). Тел.: 8-495-938-22-91

vasily.studitsky@fccc.eduФеофановА. В.FeofanovA. V.

докт. биол. наук, руководитель лаборатории оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул ИБХ РАН, проф. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-336-64-55

avfeofanov@yandex.ruКирпичниковМ. П.KirpichnikovM. P.

академик РАН, проф., докт. биол. наук, декан, зав. кафедрой биоинженерии биологического факультета МГУ, заведующий отделом биоинженерии ИБХ РАН. Тел.: 8-495-939-27-76

kirpichnikov@inbox.ruКафедра биоинженерии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12РоссияBioengineering Department, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye Gory 1–12, Moscow, 119234, RussiaRussian FederationКафедра биоинженерии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, РАН; Россия, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10РоссияBioengineering Department, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye Gory 1–12, Moscow, 119234, Russia; Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Miklukho-Maklaya ul. 16/10, 117997, Moscow, RussiaRussian FederationКафедра биоинженерии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 лаборатория эпигенетики рака, Центр исследований рака Фокс Чейз; США, штат Пенсильвания, 19111, г. Филадельфия, просп. Коттмана, д. 333РоссияBioengineering Department, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye Gory 1–12, Moscow, 119234, Russia Cancer Epigenetics Program Team, Fox Chase Cancer Center; Cottman Avenue 333, Philadelphia, PA 19111, USARussian FederationКафедра биоинженерии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, РАН; Россия, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10РоссияBioengineering Department, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye Gory 1–12, Moscow, 119234, Russia Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Miklukho-Maklaya ul. 16/10, 117997, Moscow, RussiaRussian Federation201623052016024954Copyright © Любителев А.В., Кудряшова К.С., Михайлова М.С., Малюченко Н.В., Чертков О.В., Студитский В.М., Феофанов А.В., Кирпичников М.П., 20162016Любителев А.В., Кудряшова К.С., Михайлова М.С., Малюченко Н.В., Чертков О.В., Студитский В.М., Феофанов А.В., Кирпичников М.П.Lyubitelev A.V., Kudryashova K.S., Mikhaylova M.S., Malyuchenko N.V., Chertkov O.V., Studitsky V.M., Feofanov A.V., Kirpichnikov M.P.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vestnik-bio-msu.elpub.ru/jour/article/view/327

Разработана методика синтеза флуоресцентно-меченой ДНК для сборки мононуклеосом с ДНК-линкерами длиной 40 пар нуклеотидов (п.н.). Метки Су3 и Су5 введены в линкеры на расстояниях соответственно 10 п.н. до первого и 15 п.н. после последнего нуклеотида нуклеосом-позиционирующей последовательности ДНК. В отсутствии линкерного гистона Н1.5 исследование методом флуоресцентной микроскопии одиночных комплексов выявило наличие двух равновероятных состояний нуклеосом, отличающихся конформацией ДНК-линкеров: открытой — с эффективностью переноса энергии Е между метками, равной 0,06, и закрытой — с Е = 0,37, где линкеры сближены. Связывание гистона Н1.5 с нуклеосомами происходит в наномолярном диапазоне концентраций, и скорость образования комплексов существенно выше, чем скорость их диссоциации. В комплексах происходит значительное сближение линкеров (Е = 0,73), а их конформация в области меток становится более единообразной. Разработанные нуклеосомные конструкты являются высокочувствительными флуоресцентными сенсорами для анализа структурных перестроек линкеров и в комбинации с методом микроскопии одиночных комплексов позволяют изучать структуру комплексов нуклеосом с различными архитектурными белками хроматина.

The method of synthesis of fluorescently labeled DNA allowing assembly of mononucleosomes with 40 bp linkers was developed. Cy3 and Cy5 labels were introduced in the linkers at distances of 10 bp before the first and 15 bp after the last nucleotide of the nucleosome positioning DNA sequence, respectively. In the absence of histone H1.5 fluorescence microscopy of single complexes revealed the presence of two equally probable states of nucleosomes, differing in the conformation of linkers: open one with the energy transfer efficiency E between the labels being equal to 0.06 and closed one with E = 0.37. Binding of histone H1.5 with nucleosomes occurs in nanomolar range of concentrations, and the rate of complex formation is significantly higher than the dissociation rate. In the complexes, significant convergence of DNA linkers (E = 0.73) takes place, and their conformation in the region of labels becomes more uniform. Designed nucleosomal constructs are highly sensitive fluorescent sensors for the analysis of structural rearrangements of linkers and in combination with microscopy of single complexes allow studying the structure of complexes of nucleosomes with different chromatin architectural proteins.

хроматиннуклеосомалинкерный гистон Н1флуоресценциямикроскопияодиночная молекулаchromatinnucleosomelinker histone H1fluorescencemicroscopysingle moleculeReferencesShrestha D., Jenei A., Nagy P., Vereb G., Szöllősi J. Understanding FRET as a research tool for cellular studies // Int. J. Mol. Sci. 2015. Vol.16. N 4. P. 6718–6756.Shrestha D., Jenei A., Nagy P., Vereb G., Szöllősi J. Understanding FRET as a research tool for cellular studies // Int. J. Mol. Sci. 2015. Vol.16. N 4. P. 6718–6756.Sustarsic M.K. Taking the ruler to the jungle: singlemolecule FRET for understanding biomolecular structure and dynamics in live cells // Curr. Opin. Struct. Biol. 2015 Vol. 18. P. 52–59.Sustarsic M.K. Taking the ruler to the jungle: singlemolecule FRET for understanding biomolecular structure and dynamics in live cells // Curr. Opin. Struct. Biol. 2015 Vol. 18. P. 52–59.Arai Y.N. Extensive use of FRET in biological imaging // Microscopy (Oxf). 2013. Vol. 62. P. 419–428.Arai Y.N. Extensive use of FRET in biological imaging // Microscopy (Oxf). 2013. Vol. 62. P. 419–428.Sugawa M.A., Iwane A.H., Ishii Y., Yanagida T. Single molecule FRET for the study on structural dynamics of biomolecules // Biosystems. 2007. Vol. 88. N 3. P. 243–250.Sugawa M.A., Iwane A.H., Ishii Y., Yanagida T. Single molecule FRET for the study on structural dynamics of biomolecules // Biosystems. 2007. Vol. 88. N 3. P. 243–250.Lee W., Obubuafo A., Lee Y.I., Davis L.M., Soper S.A. Single-pair fluorescence resonance energy transfer (spFRET) for the high sensitivity analysis of low-abundance proteins using aptamers as molecular recognition elements // J. Fluoresc. 2010. Vol. 20. N 1. P. 203–213.Lee W., Obubuafo A., Lee Y.I., Davis L.M., Soper S.A. Single-pair fluorescence resonance energy transfer (spFRET) for the high sensitivity analysis of low-abundance proteins using aptamers as molecular recognition elements // J. Fluoresc. 2010. Vol. 20. N 1. P. 203–213.Gansen A., Tóth K., Schwarz N., Langowski J. Structural variability of nucleosomes detected by single-pair Förster resonance energy transfer: histone acetylation, sequence variation, and salt effects // J. Phys. Chem. B. 2009. Vol. 113. N 9. P. 2604–2613.Gansen A., Tóth K., Schwarz N., Langowski J. Structural variability of nucleosomes detected by single-pair Förster resonance energy transfer: histone acetylation, sequence variation, and salt effects // J. Phys. Chem. B. 2009. Vol. 113. N 9. P. 2604–2613.Kudryashova K.S., Chertkov O.V., Nikitin D.V., Pestov N.A., Kulaeva O.I., Efremenko A.V., Solonin A.S., Kirpichnikov M.P., Studitsky V.M., Feofanov A.V. Preparation of mononucleosomal templates for analysis of transcription with RNA polymerase using spFRET // Methods Mol. Biol. 2015. Vol. 1288. P. 395–412.Kudryashova K.S., Chertkov O.V., Nikitin D.V., Pestov N.A., Kulaeva O.I., Efremenko A.V., Solonin A.S., Kirpichnikov M.P., Studitsky V.M., Feofanov A.V. Preparation of mononucleosomal templates for analysis of transcription with RNA polymerase using spFRET // Methods Mol. Biol. 2015. Vol. 1288. P. 395–412.Ngo T.T., Ha T. Nucleosomes undergo slow spontaneous gaping // Nucleic Acids Res. 2015. Vol. 43. N 8. P. 3964– 3971.Ngo T.T., Ha T. Nucleosomes undergo slow spontaneous gaping // Nucleic Acids Res. 2015. Vol. 43. N 8. P. 3964– 3971.Feofanov A.V., Kudryashova K.S., Chertkov O.V., Nikitin D.V., Pestov N.A., Kulaeva O.I., Studitsky V.M., Kirpichnikov M.P. Analysis of nucleosome transcription using singleparticle FRET // Springer Proc. Phys. 2015. Vol. 164. P. 255–260.Feofanov A.V., Kudryashova K.S., Chertkov O.V., Nikitin D.V., Pestov N.A., Kulaeva O.I., Studitsky V.M., Kirpichnikov M.P. Analysis of nucleosome transcription using singleparticle FRET // Springer Proc. Phys. 2015. Vol. 164. P. 255–260.Ngo T.T., Zhang Q., Zhou R., Yodh J.G., Ha T. Asymmetric unwrapping of nucleosomes under tension directed by DNA local flexibility // Cell. 2015. Vol.160. N 6. P. 1135–1144.Ngo T.T., Zhang Q., Zhou R., Yodh J.G., Ha T. Asymmetric unwrapping of nucleosomes under tension directed by DNA local flexibility // Cell. 2015. Vol.160. N 6. P. 1135–1144.Kudryashova K.S., Nikitin D.V., Chertkov O.V., Gerasimova N.S., Valieva M.E., Studitsky V.M., Feofanov A.V. Development of fluorescently labeled mononucleosomes for the investigation of transcription mechanisms by single complex microscopy // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2015. Vol. 70. N 4. P. 189–193.Kudryashova K.S., Nikitin D.V., Chertkov O.V., Gerasimova N.S., Valieva M.E., Studitsky V.M., Feofanov A.V. Development of fluorescently labeled mononucleosomes for the investigation of transcription mechanisms by single complex microscopy // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2015. Vol. 70. N 4. P. 189–193.Luo Y., North J.A., Poirier M.G. Single molecule fluorescence methodologies for investigating transcription factor binding kinetics to nucleosomes and DNA // Methods. 2014. Vol. 70. N 2–3. P. 108–118.Luo Y., North J.A., Poirier M.G. Single molecule fluorescence methodologies for investigating transcription factor binding kinetics to nucleosomes and DNA // Methods. 2014. Vol. 70. N 2–3. P. 108–118.Simon M.N., Shimko J.C., Forties R.A., Ferdinand M.B., Manohar M., Zhang M., Fishel, R., Ottesen J.J., Poirier M.G. Histone fold modifications control nucleosome unwrapping and disassembly // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011. Vol. 108. N 31. P. 12711–12716.Simon M.N., Shimko J.C., Forties R.A., Ferdinand M.B., Manohar M., Zhang M., Fishel, R., Ottesen J.J., Poirier M.G. Histone fold modifications control nucleosome unwrapping and disassembly // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011. Vol. 108. N 31. P. 12711–12716.Syed S.H., Goutte-Gattat D., Becker N., Meyer S., Shukla M.S., Hayes J.J., Everaers R., Angelov D., Bednar J., Dimitrov S. Single-base resolution mapping of H1-nucleosome interactions and 3D organization of the nucleosome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. Vol. 107. N 21. P. 9620–9625.Syed S.H., Goutte-Gattat D., Becker N., Meyer S., Shukla M.S., Hayes J.J., Everaers R., Angelov D., Bednar J., Dimitrov S. Single-base resolution mapping of H1-nucleosome interactions and 3D organization of the nucleosome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. Vol. 107. N 21. P. 9620–9625.Meyer S. B., Syed S.H., Goutte-Gattat D., Shukla M.S., Hayes J.J., Angelov D., Bednar J., Dimitrov S., Everaers R. From crystal and NMR structures, footprints and cryo-electron- micrographs to large and soft structures: nanoscale modeling of the nucleosomal stem // Nucleic Acids Res. 2011. Vol. 39. P. 9139–9154.Meyer S. B., Syed S.H., Goutte-Gattat D., Shukla M.S., Hayes J.J., Angelov D., Bednar J., Dimitrov S., Everaers R. From crystal and NMR structures, footprints and cryo-electron- micrographs to large and soft structures: nanoscale modeling of the nucleosomal stem // Nucleic Acids Res. 2011. Vol. 39. P. 9139–9154.Zhou B.R., Feng H., Kato H., Dai L., Yang Y., Zhou Y., Bai Y. Structural insights into the histone H1-nucleosome complex // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. Vol. 110. N 48. P. 19390–19395.Zhou B.R., Feng H., Kato H., Dai L., Yang Y., Zhou Y., Bai Y. Structural insights into the histone H1-nucleosome complex // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. Vol. 110. N 48. P. 19390–19395.Gaykalova D.A., Kulaeva O.I., Bondarenko V.A., Studitsky V.M. Preparation and analysis of uniquely positioned mononucleosomes // Methods Mol. Biol. 2009. Vol. 523. P. 109–123.Gaykalova D.A., Kulaeva O.I., Bondarenko V.A., Studitsky V.M. Preparation and analysis of uniquely positioned mononucleosomes // Methods Mol. Biol. 2009. Vol. 523. P. 109–123.Syed S.H., Goutte-Gattat D., Becker N., Meyer S., Shukla M.S., Hayes J.J., Everaers R., Angelov D., Bednar J., Dimitrov S. Single-base resolution mapping of H1-nucleosome interactions and 3D organization of the nucleosome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. Vol. 107. N 21. P. 9620–9625.Syed S.H., Goutte-Gattat D., Becker N., Meyer S., Shukla M.S., Hayes J.J., Everaers R., Angelov D., Bednar J., Dimitrov S. Single-base resolution mapping of H1-nucleosome interactions and 3D organization of the nucleosome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. Vol. 107. N 21. P. 9620–9625.Meyer S., Becker N.B., Syed S.H., Goutte-Gattat D., Shukla M.S., Hayes J.J., Angelov D, Bednar J., Dimitrov S., Everaers R. From crystal and NMR structures, footprints and cryo-electron-micrographs to large and soft structures: nanoscale modeling of the nucleosomal stem // Nucleic Acids Res. 2011. Vol. 39. N 21. P. 9139–9154.Meyer S., Becker N.B., Syed S.H., Goutte-Gattat D., Shukla M.S., Hayes J.J., Angelov D, Bednar J., Dimitrov S., Everaers R. From crystal and NMR structures, footprints and cryo-electron-micrographs to large and soft structures: nanoscale modeling of the nucleosomal stem // Nucleic Acids Res. 2011. Vol. 39. N 21. P. 9139–9154.Song F., Chen P., Sun D., Wang M., Dong L., Liang D., Xu R.M., Zhu P., Li G. Cryo-EM study of the chromatin fiber reveals a double helix twisted by tetranucleosomal units // Science. 2014. Vol. 344. N 6182. P. 376–380.Song F., Chen P., Sun D., Wang M., Dong L., Liang D., Xu R.M., Zhu P., Li G. Cryo-EM study of the chromatin fiber reveals a double helix twisted by tetranucleosomal units // Science. 2014. Vol. 344. N 6182. P. 376–380.Fan L., Roberts V.A. Complex of linker histone H5 with the nucleosome and its implications for chromatin packing // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. Vol. 103. N 22. P. 8384–8289.Fan L., Roberts V.A. Complex of linker histone H5 with the nucleosome and its implications for chromatin packing // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. Vol. 103. N 22. P. 8384–8289.Cui F., Zhurkin V.B. Distinctive sequence patterns in metazoan and yeast nucleosomes: implications for linker histone binding to AT-rich and methylated DNA // Nucleic Acids Res. 2009. Vol. 37. N 9. P. 2818–2829.Cui F., Zhurkin V.B. Distinctive sequence patterns in metazoan and yeast nucleosomes: implications for linker histone binding to AT-rich and methylated DNA // Nucleic Acids Res. 2009. Vol. 37. N 9. P. 2818–2829.Zhou B.R., Jiang J., Feng H., Ghirlando R., Xiao T.S., Bai Y. Structural mechanisms of nucleosome recognition by linker histones // Mol. Cell. 2015. Vol. 59. N 4. P. 628–638.Zhou B.R., Jiang J., Feng H., Ghirlando R., Xiao T.S., Bai Y. Structural mechanisms of nucleosome recognition by linker histones // Mol. Cell. 2015. Vol. 59. N 4. P. 628–638.Bernier M., Luo Y., Nwokelo K.C., Goodwin M., Dreher S.J., Zhang P., Parthun M.R., Fondufe-Mittendorf Y., Ottesen J.J., Poirier M.G. Linker histone H1 and H3K56 acetylation are antagonistic regulators of nucleosome dynamics // Nat. Commun. 2015. Vol. 6. P. 10152.Bernier M., Luo Y., Nwokelo K.C., Goodwin M., Dreher S.J., Zhang P., Parthun M.R., Fondufe-Mittendorf Y., Ottesen J.J., Poirier M.G. Linker histone H1 and H3K56 acetylation are antagonistic regulators of nucleosome dynamics // Nat. Commun. 2015. Vol. 6. P. 10152.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.