vestnik-bio-msuВестник Московского университета. Серия 16. БиологияVestnik Moskovskogo universiteta. Seriya 16. Biologiya0137-0952Lomonosov Moscow State University, School of Biologyvestnik-bio-msu-387Research ArticleМетодыMethodsИНДУКЦИЯ ОСТЕОГЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ОСТЕОБЛАСТОПОДОБНЫХ КЛЕТОК MG-63 ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В ТРЁХМЕРНЫХ УСЛОВИЯХ НА ФИБРОИНОВЫХ МИКРОНОСИТЕЛЯХINDUCTION OF OSTEOGENIC DIFFERENTIATION OF OSTEOBLAST-LIKE CELLS MG-63 DURING 3D CULTIVATION ON FIBROIN MICROCARRIERSКотляроваМ. С.KotliarovaM. S.

Котлярова Мария Сергеевна — аспирант кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ

Department of Bioengineering, School of Biology

kotlyarova.ms@gmail.comЖуйковВ. А.ZhuikovV. A.

Жуйков Всеволод Александрович — млдший научный сотрудник ФИЦ Биотехнологии РАН

vsevolod1905@ya.ruЧудиноваЮ. В.ChudinovaY. V.

Чудинова Юлия Владимировна — аспирант кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ

Department of Bioengineering, School of Biology

yuli4_08@mail.ruХайдаповаД. Д.KhaidapovaD. D.

Хайдапова Долгор Доржиевна — доцент кафедры физики и мелиорации почв факультета почвоведения МГУ

Department of Soil Physics and Reclamation, School of Soil Science

dkhaydapova@yandex.ruМойсеновичА. М.MoisenovichA. M.

Мойсенович Анастасия Михайловна — соискатель межкафедральной лаборатории конфокальной микроскопии биологического факультета МГУ

Laboratory of Confocal Microscopy, School of Biology

a-moisenovich@mail.ruКоньковА. С.Kon’kovA. S.

Коньков Андрей Сергеевич — соискатель межкафедральной лаборатории конфокальной микроскопии биологического факультета МГУ

Department of Bioengineering, School of Biology

andrey.s.konkov@gmail.comСафоноваЛ. А.SafonovaL. A.

Сафонова Любовь Александровна — аспирант кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ, инженер лаб. бионанотехнологий ФГБУ “ФНЦ трансплантологии и искусственных органов

saf.lyubov.msu@gmail.comБоброваМ. М.BobrovaM. M.

Боброва Мария Михайловна — аспирант кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ, инженер лаб. бионанотехнологий ФНЦ

Lomonosov Moscow State University, Moscow; Academician V.I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs, Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow

mariabobrova.msu@gmail.comАрхиповаА. Ю.ArkhipovaA. Y.

Архипова Анастасия Юрьевна — младший научный сотрудник межкафедральной лаборатории конфокальной микроскопии биологического факультета МГУ

Laboratory of Confocal Microscopy, School of Biology

anastasia-yu-arkhipova@ya.ruГончаренкоА. В.GoncharenkoA. V.

Гончаренко Анна Владимировна — ведущий научный сотрудник межкафедральной лаборатории конфокальной микроскопии биологического факультета МГУ

Laboratory of Confocal Microscopy, School of Biology

pylaevanna@gmail.comШайтанК. В.ShaitanK. V.

Шайтан Константин Вольдемарович — профессор кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ

Department of Bioengineering, School of Biology

shaytan49@ya.ruМосковский государственный университет имени М.В. Ломоносова, МоскваРоссияLomonosov Moscow State University, MoscowRussian FederationФедеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук, МоскваРоссияResearch Center of Biotechnology, RAS, MoscowRussian FederationМосковский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук, МоскваРоссияLomonosov Moscow State University, Moscow; Research Center of Biotechnology, RAS, MoscowRussian FederationМосковский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова” Минздрава России, МоскваРоссияLomonosov Moscow State University, Moscow; Academician V.I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs, Ministry of Health of the Russian Federation, MoscowRussian FederationМосковский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова” Минздрава России, МоскваРоссияLomonosov Moscow State University, MoscowRussian Federation201626102016043440Copyright © Котлярова М.С., Жуйков В.А., Чудинова Ю.В., Хайдапова Д.Д., Мойсенович А.М., Коньков А.С., Сафонова Л.А., Боброва М.М., Архипова А.Ю., Гончаренко А.В., Шайтан К.В., 20162016Котлярова М.С., Жуйков В.А., Чудинова Ю.В., Хайдапова Д.Д., Мойсенович А.М., Коньков А.С., Сафонова Л.А., Боброва М.М., Архипова А.Ю., Гончаренко А.В., Шайтан К.В.Kotliarova M.S., Zhuikov V.A., Chudinova Y.V., Khaidapova D.D., Moisenovich A.M., Kon’kov A.S., Safonova L.A., Bobrova M.M., Arkhipova A.Y., Goncharenko A.V., Shaitan K.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vestnik-bio-msu.elpub.ru/jour/article/view/387

Получены микроносители на основе фиброина шёлка. Микроносители могут использоваться в качестве субстрата для культивирования клеток, для доставки клеток при проведении клеточной терапии, а также для создания тканеинженерных конструкций. Фиброиновые микроносители были минерализованы, что привело к появлению кристаллов фосфата кальция на их поверхности. Способность минерализованных и не минерализованных микроносителей поддерживать остеогенную дифференцировку остеобластоподобных клеток линии MG-63 была оценена по уровню активности щелочной фосфатазы, раннего маркера остеогенеза. Было показано, что клетки активно пролиферировали на поверхности как минерализованных, так и немодифицированных микроносителей. Культивирование MG-63 на поверхности фиброиновых микроносителей приводило к повышению активности щелочной фосфатазы, что указывало на остеогенную дифференцировку клеток MG-63 в отсутствие индукторов. Уровень щелочной фосфатазы был выше при использовании минерализованных микроносителей. При традиционном двухмерном культивировании клеток MG-63 активность щелочной фосфатазы была близка к нулевому уровню. В отличие от традиционного монослойного культивирования при использовании микроносителей клетки находятся в трехмерных условиях, более близких к физиологическим. Это может оказывать значительное влияние на их морфологию и функциональные свойства. В ходе работы также были охарактеризованы механические свойства пористых скаффолдов, использованных для получения микроносителей. 

We have developed microcarriers made from silk fibroins. Microcarriers can be used as a substrate for cell cultivation and cell delivery during cell-based therapy, and for the construction of bioengineered tissue. Fibroin microcarriers were mineralized, which led to the appearance of calcium phosphate crystals on their surface. The ability of mineralized and non-mineralized microcarriers to support osteogenic differentiation of the osteoblast-like cell line MG-63 was estimated by alkaline phosphatase activity, an early marker of bone formation. The experiment showed cells actively proliferating on the surface of both mineralized and non-modified microcarriers. Culturing MG-63 on the surface of fibroin microcarriers resulted in an increase of alkaline phosphatase activity indicative of osteogenic differentiation of MG-63 cells in the absence of inductors. The level of alkaline phosphatase was higher when mineralized microcarriers were used. Alkaline phosphatase activity of MG-63 cells cultivated using traditional two-dimensional approaches were close to zero. As opposed to conventional monolayer culturing, microcarriers culture cells in a three-dimensional environment that is closer to physiological conditions. This can have a significant impact on their morphology and functional properties. During this study we also characterized mechanical properties of porous scaffolds used for microcarriers.

фиброиностеогенная дифференцировкаминерализациятрёхмерное культивированиемикроносительfibroinosteogenic differentiationmineralizationthree-dimensional culturemicrocarrierReferencesJustice B.A., Badr N.A., Felder R.A. 3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays // Drug Discov. Today. 2009. Vol. 14. N 1. P. 102–107.Justice B.A., Badr N.A., Felder R.A. 3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays // Drug Discov. Today. 2009. Vol. 14. N 1. P. 102–107.Sun L.Y., Lin S.Z., Li Y.S., Harn H.J., Chiou T.W. Functional cells cultured on microcarriers for use in regenerative medicine research // Cell Transplant. 2011. Vol. 20. N 1. P. 49–62.Sun L.Y., Lin S.Z., Li Y.S., Harn H.J., Chiou T.W. Functional cells cultured on microcarriers for use in regenerative medicine research // Cell Transplant. 2011. Vol. 20. N 1. P. 49–62.Costa A.R., Withers J., Rodrigues M.E., McLoughlin N., Henriques M., Oliveira R., Rudd P.M., Azeredo J. The impact of microcarrier culture optimization on the glycosylation profile of a monoclonal antibody // Springerplus. 2013. Vol. 2. N 1. P. 25.Costa A.R., Withers J., Rodrigues M.E., McLoughlin N., Henriques M., Oliveira R., Rudd P.M., Azeredo J. The impact of microcarrier culture optimization on the glycosylation profile of a monoclonal antibody // Springerplus. 2013. Vol. 2. N 1. P. 25.Chen A.K.-L., Reuveny S., Oh S.K.W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction // Biotechnol. Adv. 2013. Vol. 31. N 7. P. 1032–1046.Chen A.K.-L., Reuveny S., Oh S.K.W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction // Biotechnol. Adv. 2013. Vol. 31. N 7. P. 1032–1046.Bonartsev A.P., Yakovlev S.G., Filatova E.V., Soboleva G.M., Makhina T.K., Bonartseva G.A., Shaĭtan K.V., Popov V.O., Kirpichnikov M.P. Sustained release of the antitumor drug paclitaxel from poly(3-hydroxybutyrate)-based microspheres // Biochem. (Mosc.), Suppl., Ser. B Biomed. Chem. 2012. Vol. 6. N 1. P. 42–47.Bonartsev A.P., Yakovlev S.G., Filatova E.V., Soboleva G.M., Makhina T.K., Bonartseva G.A., Shaĭtan K.V., Popov V.O., Kirpichnikov M.P. Sustained release of the antitumor drug paclitaxel from poly(3-hydroxybutyrate)-based microspheres // Biochem. (Mosc.), Suppl., Ser. B Biomed. Chem. 2012. Vol. 6. N 1. P. 42–47.Yang Y., Rossi F.M.V., Putnins E.E. Ex vivo expansion of rat bone marrow mesenchymal stromal cells on microcarrier beads in spin culture // Biomaterials. 2007. Vol. 28. N 20. P. 3110–3120.Yang Y., Rossi F.M.V., Putnins E.E. Ex vivo expansion of rat bone marrow mesenchymal stromal cells on microcarrier beads in spin culture // Biomaterials. 2007. Vol. 28. N 20. P. 3110–3120.Chen M., Wang X., Ye Z., Zhang Y., Zhou Y., Tan W.-S. A modular approach to the engineering of a centimetersized bone tissue construct with human amniotic mesenchymal stem cells-laden microcarriers // Biomaterials. 2011. Vol. 32. N. 30. P. 7532–7542.Chen M., Wang X., Ye Z., Zhang Y., Zhou Y., Tan W.-S. A modular approach to the engineering of a centimetersized bone tissue construct with human amniotic mesenchymal stem cells-laden microcarriers // Biomaterials. 2011. Vol. 32. N. 30. P. 7532–7542.Müller P., Bulnheim U., Diener A., Lüthen F., Teller M., Klinkenberg E.-D., Neumann H.-G., Nebe B., Liebold A., Steinhoff G., Rychly J. Calcium phosphate surfaces promote osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells // J. Cell. Mol. Med. 2007. Vol. 12. N 1. P. 281–291.Müller P., Bulnheim U., Diener A., Lüthen F., Teller M., Klinkenberg E.-D., Neumann H.-G., Nebe B., Liebold A., Steinhoff G., Rychly J. Calcium phosphate surfaces promote osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells // J. Cell. Mol. Med. 2007. Vol. 12. N 1. P. 281–291.Moisenovich M.M., Pustovalova O., Shackelford J., Vasiljeva T.V, Druzhinina T.V., Kamenchuk Y.A., Guzeev V.V, Sokolova O.S., Bogush V.G., Debabov V.G., Kirpichnikov M.P., Agapov I.I. Tissue regeneration in vivo within recombinant spidroin 1 scaffolds // Biomaterials. 2012. Vol. 33. N 15. P. 3887–3898.Moisenovich M.M., Pustovalova O., Shackelford J., Vasiljeva T.V, Druzhinina T.V., Kamenchuk Y.A., Guzeev V.V, Sokolova O.S., Bogush V.G., Debabov V.G., Kirpichnikov M.P., Agapov I.I. Tissue regeneration in vivo within recombinant spidroin 1 scaffolds // Biomaterials. 2012. Vol. 33. N 15. P. 3887–3898.Arkhipova A.Y., Kotlyarova M.S., Novichkova S.G., Agapova O.I., Kulikov D.A., Kulikov A.V., Drutskaya M.S., Agapov I.I., Moisenovich M.M. New silk fibroin-based bioresorbable microcarriers // Bull. Exp. Biol. Med. 2016. Vol. 160. N 4. P. 491–494.Arkhipova A.Y., Kotlyarova M.S., Novichkova S.G., Agapova O.I., Kulikov D.A., Kulikov A.V., Drutskaya M.S., Agapov I.I., Moisenovich M.M. New silk fibroin-based bioresorbable microcarriers // Bull. Exp. Biol. Med. 2016. Vol. 160. N 4. P. 491–494.Moisenovich M.M., Kulikov D.A., Arkhipova A.Y., Malyuchenko N.V., Kotlyarova M.S., Goncharenko A.V., Kulikov A.V., Mashkov A.E., Agapov I.I., Paleev F.N., Svistunov A.A., Kirpichnikov M.P. Fundamental bases for the use of silk fibroin-based bioresorbable microvehicles as an example of skin regeneration in therapeutic practice // Ter. Arkh. 2015. Vol. 87. N 12. P. 66–72Moisenovich M.M., Kulikov D.A., Arkhipova A.Y., Malyuchenko N.V., Kotlyarova M.S., Goncharenko A.V., Kulikov A.V., Mashkov A.E., Agapov I.I., Paleev F.N., Svistunov A.A., Kirpichnikov M.P. Fundamental bases for the use of silk fibroin-based bioresorbable microvehicles as an example of skin regeneration in therapeutic practice // Ter. Arkh. 2015. Vol. 87. N 12. P. 66–72Correia C., Bhumiratana S., Yan L.-P., Oliveira A.L., Gimble J. M., Rockwood D., Kaplan D.L., Sousa R.A., Reis R.L., Vunjak-Novakovic G. Development of silk-based scaffolds for tissue engineering of bone from human adipose-derived stem cells // Acta Biomater. 2012. Vol. 8. N 7. P. 2483–2492.Correia C., Bhumiratana S., Yan L.-P., Oliveira A.L., Gimble J. M., Rockwood D., Kaplan D.L., Sousa R.A., Reis R.L., Vunjak-Novakovic G. Development of silk-based scaffolds for tissue engineering of bone from human adipose-derived stem cells // Acta Biomater. 2012. Vol. 8. N 7. P. 2483–2492.Agapov I.I., Moisenovich M.M., Druzhinina T.V., Kamenchuk Y.A., Trofimov K.V., Vasilyeva T.V., Konkov A.S., Arhipova A.Y., Sokolova O.S., Guzeev V.V., Kirpichnikov M.P. Biocomposite scaffolds containing regenerated silk fibroin and nanohydroxyapatite for bone tissue regeneration // Dokl. Biochem. Biophys. 2011. Vol. 440. N 1. P. 228–230.Agapov I.I., Moisenovich M.M., Druzhinina T.V., Kamenchuk Y.A., Trofimov K.V., Vasilyeva T.V., Konkov A.S., Arhipova A.Y., Sokolova O.S., Guzeev V.V., Kirpichnikov M.P. Biocomposite scaffolds containing regenerated silk fibroin and nanohydroxyapatite for bone tissue regeneration // Dokl. Biochem. Biophys. 2011. Vol. 440. N 1. P. 228–230.Yang L., Hedhammar M., Blom T., Leifer K., Johansson J., Habibovic. P, van Blitterswijk C.A. Biomimetic calcium phosphate coatings on recombinant spider silk fibres // Biomed. Mater. 2010. Vol. 5. N. 4. 045002.Yang L., Hedhammar M., Blom T., Leifer K., Johansson J., Habibovic. P, van Blitterswijk C.A. Biomimetic calcium phosphate coatings on recombinant spider silk fibres // Biomed. Mater. 2010. Vol. 5. N. 4. 045002.Karpushkin E., Dušková-Smrčková M., Remmler T., Lapčíková M. Dušek K. Rheological properties of homogeneous and heterogeneous poly(2-hydroxyethyl methacrylate) hydrogels // Polym. Int. 2012. Vol. 61. N 2. P. 328–336.Karpushkin E., Dušková-Smrčková M., Remmler T., Lapčíková M. Dušek K. Rheological properties of homogeneous and heterogeneous poly(2-hydroxyethyl methacrylate) hydrogels // Polym. Int. 2012. Vol. 61. N 2. P. 328–336.Czekanska E.M., Stoddart M.J., Richards R.G., Hayes J.S. In search of an osteoblast cell model for in vitro research // Eur. Cell. Mater. 2012. Vol. 24. P. 1–17.Czekanska E.M., Stoddart M.J., Richards R.G., Hayes J.S. In search of an osteoblast cell model for in vitro research // Eur. Cell. Mater. 2012. Vol. 24. P. 1–17.Moisenovich M.M., Arkhipova A.Y., Orlova A.A., Drutskaya M.S., Volkova S.V., Zacharov S.E., Agapov I.I., Kirpichnikov M.P. Composite Scaffolds containing silk fibroin, gelatin, and hydroxyapatite for bone tissue regeneration and 3D Cell Culturing // Acta Naturae. 2014. Vol. 6. N 1. P. 96–101.Moisenovich M.M., Arkhipova A.Y., Orlova A.A., Drutskaya M.S., Volkova S.V., Zacharov S.E., Agapov I.I., Kirpichnikov M.P. Composite Scaffolds containing silk fibroin, gelatin, and hydroxyapatite for bone tissue regeneration and 3D Cell Culturing // Acta Naturae. 2014. Vol. 6. N 1. P. 96–101.Tseng P.C., Young T.H., Wang T.M., Peng H.W., Hou S.M., Yen M.L. Spontaneous osteogenesis of MSCs cultured on 3D microcarriers through alteration of cytoskeletal tension // Biomaterials. 2012. Vol. 33. N. 2. P. 556–564.Tseng P.C., Young T.H., Wang T.M., Peng H.W., Hou S.M., Yen M.L. Spontaneous osteogenesis of MSCs cultured on 3D microcarriers through alteration of cytoskeletal tension // Biomaterials. 2012. Vol. 33. N. 2. P. 556–564.Al-Munajjed A.A., Plunkett N.A., Gleeson J.P., Weber T., Jungreuthmayer C., Levingstone T., Hammer J., O’Brien F.J. Development of a biomimetic collagen-hydroxyapatite scaffold for bone tissue engineering using a SBF immersion technique // J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 2009. Vol. 90B. N 2. P. 584–591.Al-Munajjed A.A., Plunkett N.A., Gleeson J.P., Weber T., Jungreuthmayer C., Levingstone T., Hammer J., O’Brien F.J. Development of a biomimetic collagen-hydroxyapatite scaffold for bone tissue engineering using a SBF immersion technique // J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 2009. Vol. 90B. N 2. P. 584–591.Li X., Huang Y., Zheng L., Liu H., Niu X., Huang J., Zhao F., Fan Y. Effect of substrate stiffness on the functions of rat bone marrow and adipose tissue derived mesenchymal stem cells in vitro // J. Biomed. Mater. Res. A2014. Vol. 102. N 4. P. 1092–1101.Li X., Huang Y., Zheng L., Liu H., Niu X., Huang J., Zhao F., Fan Y. Effect of substrate stiffness on the functions of rat bone marrow and adipose tissue derived mesenchymal stem cells in vitro // J. Biomed. Mater. Res. A2014. Vol. 102. N 4. P. 1092–1101.Cheng Q., Rutledge K., Jabbarzadeh E. Carbon nanotube-poly(lactide-co-glycolide) composite scaffolds for bone tissue engineering applications // Ann. Biomed. Eng. 2013. Vol. 41. N 5. P. 904–916.Cheng Q., Rutledge K., Jabbarzadeh E. Carbon nanotube-poly(lactide-co-glycolide) composite scaffolds for bone tissue engineering applications // Ann. Biomed. Eng. 2013. Vol. 41. N 5. P. 904–916.Zaari N., Rajagopalan P., Kim S.K., Engler A.J., Wong J.Y. Photopolymerization in microfluidic gradient generators: microscale control of substrate compliance to manipulate cell response // Adv. Mater. 2004. Vol. 16. N 23–24. P. 2133–2137.Zaari N., Rajagopalan P., Kim S.K., Engler A.J., Wong J.Y. Photopolymerization in microfluidic gradient generators: microscale control of substrate compliance to manipulate cell response // Adv. Mater. 2004. Vol. 16. N 23–24. P. 2133–2137.Dupont S., Morsut L., Aragona M., Enzo E., Giulitti S., M. Cordenonsi, Zanconato F., Le Digabel J., Forcato M., Bicciato S., Elvassore N., Piccolo S. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction // Nature. 2011. Vol. 474. N 7350. P. 179–183.Dupont S., Morsut L., Aragona M., Enzo E., Giulitti S., M. Cordenonsi, Zanconato F., Le Digabel J., Forcato M., Bicciato S., Elvassore N., Piccolo S. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction // Nature. 2011. Vol. 474. N 7350. P. 179–183.Wang H.B., Dembo M., Wang Y.L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2000. Vol. 279. N 5. P. C1345–1350.Wang H.B., Dembo M., Wang Y.L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2000. Vol. 279. N 5. P. C1345–1350.Шрамм Г. Основы практической реологии и реометрии. М: КолосС, 2003. 312 c.Шрамм Г. Основы практической реологии и реометрии. М: КолосС, 2003. 312 c.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.