Особенности использования 2,6-дихлорофенолиндофенола в качестве акцептора электронов в исследованиях фотосинтеза

2,6-дихлорофенолиндофенол (ДХФИФ) – редокс-индикатор, широко используемый для исследования реакций переноса электрона в биологических системах, в том числе в процессе фотосинтеза. При восстановлении ДХФИФ, поглощающий свет в видимой области, обесцвечивается. ДХФИФ существует в растворе в двух формах – «розовой» и «синей», которые переходят друг в друга при протонировании/депротонировании. Нами исследована рН-зависимость скорости восстановления ДХФИФ фотосистемой 2 (ФС2) при двух длинах волн – 522 нм (изобестическая точка ДХФИФ) и 600 нм (вблизи максимума поглощения депротонированной «синей» формы). Показано, что при изменении рН среды измерения на длине волны 600 нм требуют внесения поправок, связанных с изменением соотношения «синей» и «розовой» форм акцептора, а также использования для расчета скорости восстановления ДХФИФ параметра рК этого акцептора, значения которого варьируют в различных источниках. Измерения в изобестической точке (522 нм) позволяют избежать этих сложностей. Также нами установлено, что максимум на рН-зависимости скорости восстановления ДХФИФ ФС2 сдвинут примерно на одну единицу в кислую область относительно максимума рН-зависимости скорости восстановления акцепторной пары 2,6-дихлоро-п-бензохинон – феррицианид калия. Этот сдвиг может быть связан с меньшей доступностью QB-сайта на акцепторной стороне ФС2 для заряженной депротонированной формы ДХФИФ по сравнению с незаряженной протонированной формой.

1. Wiwczar J., Brudvig G.W. Alternative electron acceptors for photosystem II // Photosynthesis: structures, mechanisms, and applications / Eds. H. Hou, M. Najafpour, G. Moore, and S. Allakhverdiev. Cham: Springer, 2017. P. 51−66.

2. Vernon L.P., Shaw E.R. Photoreduction of 2,6-dichlorophenolindophenol by diphenylcarbazide: a photosystem 2 reaction catalyzed by tris-washed chloroplasts and subchloroplast fragments // Plant Physiol. 1969. Vol. 44. N 11. P. 1645−1649.

3. Chernev P., Fischer S., Hoffmann J., Oliver N., Assunção R., Yu B., Burnap R.L., Zaharieva I., Nürnberg D.J., Haumann M., Dau H. Light-driven formation of manganese oxide by today’s photosystem II supports evolutionarily ancient manganese-oxidizing photosynthesis // Nat. Commun. 2020. Vol. 11. N 1: 6110.

4. Lovyagina E.R., Loktyushkin A.V., Semin B.K. Effective binding of Tb3+ and La3+ cations on the donor side of Mn-depleted photosystem II // J. Biol. Inorg. Chem. 2021. Vol. 26. N 1. P. 1−11.

5. Eröss K., Svehla G., Erdey L. The use of 2,6-dichlorophenolindophenol as indicator in acid-base titrations // Anal. Chim. Acta. 1964. Vol. 31. P. 246−250.

6. Berthold D.A., Babcock G.T., Yocum C.F. A highly resolved, oxygen evolving photosystem II preparation from spinach thylakoid membranes: EPR and electron transport properties // FEBS Lett. 1981. Vol. 134. N 2. P. 231−234.

7. Loktyushkin A.V., Lovyagina E.R., Semin B.K. Interaction of terbium cations with the donor side of photosystem II in higher plants // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2019. Vol. 74. N 2. P. 81–85.

8. Dunahay T.G., Staechelin L.A., Seibert M., Ogilvie P.D., Berg S.P. Structural biochemical and biophysical characterization of four oxygen-evolving photosystem 2 preparations from spinach // Biochim. Biophys. Acta Bioenerg. 1984. Vol. 764. N 2. P. 179−193.

9. Kurreck J., Seeliger A.G., Reifarth F., Karge M., Renger G. (1995). Reconstitution of the endogenous plastoquinone pool in photosystem II (PS II) membrane fragments, inside-out-vesicles, and PS II core complexes from spinach // Biochemistry. 1995. Vol. 34. N 48. P. 15721−15731.

10. Porra R.J., Thompson W.A., Kriedemann P.E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy // Biochim. Biophys. Acta Bioenerg. 1989. Vol. 975. N 3. P. 384–394.

11. Tonomura B., Nakatani H., Ohnishi M., Yamaguchi-Ito J., Hiromi K. Test reactions for a stopped-flow apparatus: Reduction of 2,6-dichlorophenolindophenol and potassium ferricyanide by L-ascorbic acid // Anal. Biochem. 1978. Vol. 84. N 2. P. 370−383.

12. Petrova A., Mamedov M., Ivanov B., Semenov A., Kozuleva M. Effect of artificial redox mediators on the photoinduced oxygen reduction by photosystem I complexes // Photosyn. Res. 2018. Vol. 137. N 3. P. 421−429.

13. Jahn B., Jonasson N.S., Hu H., Singer H., Pol A., Good N.M., Op den Camp H.J.M., Martinez-Gomez N.C., Daumann L.J. Understanding the chemistry of the artificial electron acceptors PES, PMS, DCPIP and Wurster’s Blue in methanol dehydrogenase assays // J. Biol. Inorg. Chem. 2020. Vol. 25. N 2. P. 199−212.

14. Armstrong J.M.D. The molar extinction coefficient of 2, 6-dichlorophenol indophenol // Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj. 1964. Vol. 86. N 1. P. 194−197.

15. Izawa S. Acceptors and donors and chloroplast electron transport // Methods in Enzymology. Photosynthesis and Nitrogen Fixation – Part C, vol. 69 / Eds. A. San Pietro. Cambridge: Academic Press, 1980. P. 413−434.

16. Schlodder E., Meyer B. pH dependence of oxygen evolution and reduction kinetics of photooxidized chlorophyll aII (P-680) in Photosystem II particles from Synechococcus sp // Biochim. Biophys. Acta Bioenerg. 1987. Vol. 890. N 1. P. 23−31.

17. Vass I., Styring S. pH-dependent charge equilibria between tyrosine-D and the S states in photosystem II. Estimation of relative midpoint redox potentials // Biochemistry. 1991. Vol. 30. N 3. P. 830−839.

18. Haddy A., Hatchell J.A., Kimel R.A., Thomas R. Azide as a competitor of chloride in oxygen evolution by photosystem II // Biochemistry. 1999. Vol. 38. N 19. P. 6104−6110.

19. Schiller H., Dau H. Preparation protocols for high-activity photosystem II membrane particles of green algae and higher plants, pH dependence of oxygen evolution and comparison of the S2-state multiline signal by X-band EPR spectroscopy // J. Photochem. Photobiol. B. 2000. Vol. 55. N 2−3. P. 138−144.

20. Semin B.K., Davletschina L.N., Aleksandrov A.Yu., Lanchinskaya V.Yu., Novakova A.A., Ivanov I.I. pH-dependence of iron binding to the donor side of photosystem II // Biochemistry (Mosc.). 2004. Vol. 69. N 3. P. 410–419.

21. Damoder R., Dismukes G.C. pH dependence of the multiline, manganese EPR signal for the ‘S2’state in PS II particles: Absence of proton release during the S1 → S2 electron transfer step of the oxygen evolving system // FEBS Lett. 1984. Vol. 174. N 1. P. 157−161.

22. Semin B.K., Davletshina L.N., Timofeev K.N., Ivanov I.I., Rubin A.B., Seibert M. Production of reactive oxygen species in decoupled, Ca2+-depleted PSII and their use in assigning a function to chloride on both sides of PSII // Photosyn. Res. 2013. Vol. 117. N 1. P. 385−399.

23. Ono T., Inoue Y. Discrete extraction of the Ca atom functional for O2 evolution in higher plant photosystem II by a simple low pH treatment // FEBS Lett. 1988. Vol. 227. N 2. P. 147−152.

24. Zharmukhamedov S.K., Allakhverdiev S.I. Chemical inhibitors of photosystem II // Russian J. Plant Physiol. 2021. Vol. 68. N 2. P. 212−227.