Ключевые транскриптомные характеристики нативного ритмоводителя сердца крысы, их изменение при культивировании неонатальных кардиомиоцитов и использование для оценки пейсмекерной компетентности

Важной задачей на пути создания компетентного клеточного эквивалента биологического пейсмекера сердца для терапии сердечно-сосудистых заболеваний является оценка способности культивируемых кардиомиоцитов в конгломератах, слоях или псевдоткани к автоматической спонтанной активности. Известно, что электрофизиологические и тканевые свойства культивируемых кардиомиоцитарных структур существенно отличаются от нативных. В данной работе, на основании сопоставления транскрипционного профиля, оценки уровня экспрессии ключевых генов в ткани синоатриального узла (САУ), предсердия, неонатальных и культивируемых кардиомиоцитарных конгломератов крысы, предложены индексы пейсмекерной компетентности (ИПК), характеризующие способность (компетентность) клеточных структур к функционированию в качестве ритмоводителя. С помощью анализа данных секвенирования мРНК установлено, что при культивировании неонатальных кардиомиоцитов происходит существенное изменение профиля экспрессии функционально значимых генов, которое усиливает отличие фенотипа формирующихся конгломератов как от пейсмекера САУ, так и от сократительного миокарда. Впервые показано, что удовлетворительные ИПК могут быть получены на основе оценки уровня мРНК транскриптов не более четырех генов, включающих антагонистически экспрессируемые в САУ и сократительном миокарде пары транскрипционных факторов (Tbx3, Tbx18 и Nkx2.5, Gata4) либо пары ионных каналов (Hcn4, Kcnj2) и щелевых контактов (Gjc1, Gja1). Использование ИПК упрощает и ускоряет оценку функциональных свойств искусственных спонтанно-активных кардиомиоцитарных клеточных конструкций.

1. Csepe T.A., Kalyanasundaram A., Hansen B.J., Zhao J., Fedorov V.V. Fibrosis: a structural modulator of sinoatrial node physiology and dysfunction. Front. Physiol. 2015;6:37.

2. Dobrzynski H., Boyett M.R., Anderson R.H. New insights into pacemaker activity: promoting understanding of sick sinus syndrome. Circulation. 2007;115(14):1921–1932.

3. Cingolani E., Goldhaber J.I., Marbán E. Next-gen­eration pacemakers: from small devices to biological pace­makers. Nat. Rev. Cardiol. 2018;15(3):139–150.

4. Naumova N., Iop L. Bioengineering the cardiac con­duction system: advances in cellular, gene, and tissue engi­neering for heart rhythm regeneration. Front. Bioeng. Bio­technol. 2021;(9):673477.

5. Воронина Я.А., Кархов А.М., Кузьмин, В.С. Со­временные представления о структурной основе и мо­лекулярных механизмах трансмембранного транспорта Сl в кардиомиоцитах. Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16: Био­логия. 2024;79(2S):22–36.

6. Park D.S., Fishman G.I. The cardiac conduction system. Circulation. 2011;123(8):904-915.

7. Boyett M.R, Honjo H., Kodama I. The sinoatrial node, a heterogeneous pacemaker structure. Cardiovasc. Res. 2000;47(4):658–687.

8. Dobrzynski H., Li J., Tellez J., Greener I.D., Nikol­ski V.P., Wright S.E., Parson S.H., Jones S.A., Lancaster M.K., Yamamoto M., Honjo H., Takagishi Y., Kodama I., Efi­mov I.R., Billeter R., Boyett M.R. Computer three-dimension­al reconstruction of the sinoatrial node. Circulation. 2005;111(7):846–854.

9. Schweizer P.A., Darche F.F., Ullrich N.D., Gesch-will P., Greber B., Rivinius R., Seyler C., Müller-Decker K., Draguhn A., Utikal J., Koenen M., Katus H.A., Thomas D. Subtypespecific differentiation of cardiac pacemaker cell clus­ters from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. Ther. 2017;8(1):229.

10. Protze S.I., Liu J., Nussinovitch U., Ohana L., Backx P.H., Gepstein L., Keller G.M. Sinoatrial node cardi­omyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nat. Biotechnol. 2017;35(1):56–68.

11. Zhao H., Wang F., Zhang W., Yang M., Tang Y., Wang X., Zhao Q., Huang C. Overexpression of TBX3 in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) increases their differentiation into cardiac pacemaker-like cells. Biomed. Pharmacother. 2020;130:110612.

12. Gorabi A.M., Hajighasemi S., Khori V., Soleima­ni M., Rajaei M., Rabbani S., Atashi A., Ghiaseddin A., Saeid A.K., Ahmadi Tafti H., Sahebkar A. Functional bio­logical pacemaker generation by T-Box18 protein expres­sion via stem cell and viral delivery approaches in a murine model of complete heart block. Pharmacol. Res. 2019;141:443–450.

13. Bakker M.L., Boink G.J.J., Boukens B.J., Ver-kerk A.O., van den Boogaard M., den Haan A.D., Hoogaars W.M., Buermans H.P., de Bakker J.M., Seppen J., Tan H.L., Moorman A.F., ‘t Hoen P.A., Christoffels V.M. T-box transcription factor TBX3 reprogrammes mature cardiac myocytes into pacemaker-like cells. Cardiovasc. Res. 2012;94(3):439–449.

14. Кузьмин В.С., Каменский А.А. Молекулярные механизмы онтогенеза ритмоводителя сердца у позво­ночных животных. Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16: Биоло­гия. 2021;76(4):183–201.

15. Muñoz V., Campbell K., Shibayama J. Fibro-blasts: modulating the rhythm of the heart. J Physiol. 2008;586(10):2423–2424.

16. Fahrenbach J.P., Mejia-Alvarez R., Banach K. The relevance of non-excitable cells for cardiac pacemaker func­tion. J. Physiol. 2007;585(Pt. 2):565–578.

17. James T.N. Anatomy of the human sinus node. Anat. Rec. 1961;141:109–139.

18. Chandler N.J., Greener I.D., Tellez J.O., Inada S., Musa H., Molenaar P., Difrancesco D., Baruscotti M., Longhi R., Anderson R.H., Billeter R., Sharma V., Sigg D.C., Boyett M.R., Dobrzynski H. Molecular architec­ture of the human sinus node: insights into the function of the cardiac pacemaker. Circulation. 2009;119(12):1562–1575.

19. Dobrzynski H., Anderson R.H., Atkinson A., et al. Structure, function and clinical relevance of the cardiac con­duction system, including the atrioventricular ring and out­flow tract tissues. Pharmacol. Ther. 2013;139(2):260–288.

20. Chandler N.J., Greener I.D., Tellez J.O., Inada S., Musa H., Molenaar P., Difrancesco D., Baruscotti M., Longhi R., Anderson R.H., Billeter R., Sharma V., Sigg D.C., Boyett M.R., Dobrzynski H. Molecular architec­ture of the human sinus node: insights into the function of the cardiac pacemaker. Circulation. 2009;119(12):1562–1575.

21. Aminu A.J., Petkova M., Atkinson A.J., Yanni J., Morris A.D., Simms R.T., Chen W., Yin Z., Kuniew­icz M., Holda M.K., Kuzmin V.S., Perde F., Molenaar P., Dobrzynski H. Further insights into the molecular com­plexity of the human sinus node – The role of ‘novel’ tran­scription factors and microRNAs. Prog. Biophys. Mol. Biol. 2021;166:86–104.

22. Mommersteeg M.T.M., Hoogaars W.M.H., Prall O.W.J., de Gier-de Vries C., Wiese C., Clout D.E., Papaioannou V.E., Brown N.A., Harvey R.P., Moor­man A.F., Christoffels V.M. Molecular pathway for the localized formation of the sinoatrial node. Circ. Res. 2007;100(3):354–362.

23. Goodyer W.R., Beyersdorf B.M., Paik D.T., Tian L., Li G., Buikema J.W., Chirikian O., Choi S., Venka­traman S., Adams E.L., Tessier-Lavigne M., Wu J.C., Wu S.M. Transcriptomic. Transcriptomic profiling of the de­veloping cardiac conduction system at single-cell resolution. Circ. Res. 2019;125(4):379–397.

24. de Jong T.V., Pan Y., Rastas P., et al. A revamped rat reference genome improves the discovery of genetic di­versity in laboratory rats. Cell. Genom. 2024;4(4):100527.

25. Ensembl [Электронный ресурс]. 2025. URL: https://www.ensembl.org (дата обращения: 01.02.2025).

26. Love M.I., Huber W., Anders S. Moderated estima­tion of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome. Biol. 2014;15(12):550.

27. Pustovit O.B., Samoilova D.V., Abramochkin D.V., Filatova T.S., Kuzmin V.S. α1-adrenergic receptors accom­panied by GATA4 expression are related to proarrhythmic conduction and automaticity in rat interatrial septum. J. Physiol. Biochem. 2022;78(4):793–805.

28. Bioconductor [Электронный ресурс]. 2025. URL: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html (дата обращения: 01.02.2025).

29. Bioconductor [Электронный ресурс]. 2025. URL: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html (дата обращения: 01.02.2025).

30. van Eif V.W.W., Devalla H.D., Boink G.J.J., Christoffels V.M. Transcriptional regulation of the cardiac conduction system. Nat. Rev. Cardiol. 2018;15(10):617–630.

31. DiFrancesco D. The role of the funny current in pacemaker activity. Circ. Res. 2010;106(3):434-446.

32. Lakatta E.G., Maltsev V.A., Vinogradova T.M. A coupled SYSTEM of intracellular Ca2+ clocks and sur­face membrane voltage clocks controls the timekeeping mechanism of the heart’s pacemaker. Circ. Res. 2010;106(4):659–673.

33. Man J., Barnett P., Christoffels V.M. Structure and function of the Nppa-Nppb cluster locus during heart development and disease. Cell. Mol. Life. Sci. 2018;75(8):1435–1444.

34. Samad M., Malempati S., Restini C.B.A. Natriu­retic peptides as biomarkers: Narrative review and considera­tions in cardiovascular and respiratory dysfunctions. Yale. J. Biol. Med. 2023;96(1):137–149.

35. Hotchkiss A., Feridooni T., Baguma-Nibashe­ka M., McNeil K., Chinni S., Pasumarthi K.B. Atrial natriuretic peptide inhibits cell cycle activity of embryonic cardiac progenitor cells via its NPRA receptor signaling axis. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2015;308(7):C557–C569.

36. Eppenberger-Eberhardt M., Messerli M., Eppen­berger H.M., Reinecke M. New occurrence of atrial natriu­retic factor and storage in secretorially active granules in adult rat ventricular cardiomyocytes in long-term culture. J. Mol. Cell. Cardiol. 1993;25(7):753–757.

37. Gassanov N., Er F., Zagidullin N., Hoppe U.C. En­dothelin induces differentiation of ANP-EGFP expressing embryonic stem cells towards a pacemaker phenotype. FASEB J. 2004;18(14):1710–1712.

38. Houweling A.C., van Borren M.M., Moor-man A.F., Christoffels V.M. Expression and regulation of the atrial natriuretic factor encoding gene Nppa during development and disease. Cardiovasc. Res. 2005;67(4):583–593.

39. Fu S., Ping, P., Wang F., Luo L. Synthesis, secre­tion, function, metabolism and application of natriuretic peptides in heart failure. J. Biol. Eng. 2018;12(1):2.

40. Kanter H.L., Laing J.G., Beau S.L., Beyer E.C., Saffitz J.E. Distinct patterns of connexin expression in ca­nine Purkinje fibers and ventricular muscle. Circ. Res. 1993;72(5):1124–1131.

41. Saffitz J.E., Schuessler R.B. Connexin-40, bun­dle-branch block, and propagation at the Purkinje-myocyte junction. Circ. Res. 2000;87(10):835–836.

42. Harris B.S., Spruill L., Edmonson A.M., Rack­ley M.S., Benson D.W., O’Brien T.X., Gourdie R.G. Differ­entiation of cardiac Purkinje fibers requires precise spatio­temporal regulation of Nkx2-5 expression. Dev. Dyn. 2006;235(1):38–49.

43. Govindapillai A., Hotchkiss A., Baguma-Nibashe­ka M., Rose R.A., Miquerol L., Smithies O., Maeda N., Pa­sumarthi K.B.S. Characterizing the role of atrial natriuretic peptide signaling in the development of embryonic ventricu­lar conduction system. Sci. Rep. 2018;8(1):6939.

44. Snarr B.S., O’Neal J.L., Chintalapudi M.R., Wir­rig E.E., Phelps A.L., Kubalak S.W., Wessels A. Isl1 ex­pression at the venous pole identifies a novel role for the second heart field in cardiac development. Circ. Res. 2007;101(10):971–974.

45. Wiese C., Grieskamp T., Airik R., Mommer­steeg M.T., Gardiwal A., de Gier-de Vries C., Schuster- Gossler K., Moorman A.F., Kispert A., Christoffels V.M. Formation of the sinus node head and differentiation of sinus node myocardium are independently regulated by Tbx18 and Tbx3. Circ. Res. 2009;104(3):388–397.

46. Stefanovic S., Christoffels V.M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cell. Mol. Life Sci. 2015;72(20):3871–3881.

47. Ma Q., Zhou B., Pu W.T. Reassessment of Isl1 and Nkx2-5 cardiac fate maps using a Gata4-based reporter of Cre activity. Dev. Biol. 2008;323(1):98–104.