РАЗРАБОТКА ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫХ МОНОНУКЛЕОСОМ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ ТРАНСКРИПЦИИ МЕТОДОМ МИКРОСКОПИИ ОДИНОЧНЫХ КОМПЛЕКСОВ

Флуоресцентная микроскопия одиночных молекул и комплексов становится все более востребованным методом изучения нуклеосом и функционально важных процессов с их участием. В данной работе на основе флуоресцентно-меченой матрицы ДНК разработаны строго позиционированные мононуклеосомы, которые являются новым инструментом для исследования структурных перестроек в хроматине в процессе транскрипции РНК-полимеразой (РНКП). В нетранскрибируемую цепь ДНК были введены два флуорофора — Cy3 (донор) и Cy5 (акцептор), которые после укладки ДНК на гистоновом октамере оказываются в средней части нуклеосомы на соседних участках ДНК на расстоянии менее 60 Å и взаимодействуют по механизму Фёрстеровского резонансного переноса энергии (Förster resonance energy transfer, FRET). Изменение структуры нуклеосомы регистрировали по изменению эффективности FRET при изучении одиночных комплексов нуклеосом с РНКП методом флуоресцентной микроскопии. Показано, что введение меток не повлияло на способность РНКП транскрибировать нуклеосомы. Получены и охарактеризованы открытый комплекс с РНКП, а также элонгационные комплексы, остановленные в положениях –39 и –5 до границы нуклеосомы. Показано, что после завершения транскрипции более 80% нуклеосом сохраняют свою структуру, восстанавливая исходную укладку ДНК на гистоновом октамере. Разработанная экспериментальная система открывает новые возможности изучения структуры нуклеосом и модулирующего воздействия на них различных белковых шаперонов и ремоделирующих хроматин комплексов.

1. Luger K., Mäder A.W., Richmond R.K., Sargent D.F., Richmond T.J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Ǻ resolution // Nature. 1997. Vol. 389. N 6648. P. 251–260.

2. Chang H.W., Kulaeva O.I., Shaytan A.K., Kibanov M., Kuznedelov K., Severinov K.V., Kirpichnikov M.P., Clark D.J., Studitsky V.M. Analysis of the mechanism of nucleosome survival during transcription // Nucleic Acids Res. 2014. Vol. 42. N 3. P. 1619–1627.

3. Chang H.W., Shaytan A.K., Hsieh F.-K., Kulaeva O.I., Kirpichnikov M.P, Studitsky V.M. Structural analysis of the key intermediate formed during transcription through a nucleosome // Trends Cell. Mol. Biol. 2013. Vol. 8. P. 13–23.

4. Walter W., Studitsky V.M. Construction, analysis, and transcription of model nucleosomal templates // Methods. 2004. Vol. 33. N 1. P. 18–24.

5. Gaykalova D.A., Kulaeva O.I., Bondarenko V.A., Studitsky V.M. Preparation and analysis of uniquely positioned mononucleosomes // Methods Mol. Biol. 2009. Vol. 523. P. 109–123.

6. Gaykalova D.A., Kulaeva O.I., Pestov N.A., Hsieh F.K., Studitsky V.M. Experimental analysis of the mechanism of chromatin remodeling by RNA polymerase II // Methods Enzymol. 2012. Vol. 512. P. 293–314.

7. Buning R., van Noort J. Single-pair FRET experiments on nucleosome conformational dynamics // Biochimie. 2010. Vol. 92. N 12. P. 1729–1740.

8. Choy J.S., Lee T.H. Structural dynami cs of nucleosomes at single-molecule resolution // Trends Biochem. Sci. 2012. Vol. 37. N 10. P. 425–435.

9. Walter W., Kireeva M.L., Tchernajenko V., Kashlev M., Studitsky V.M. Assay of the fate of the nucleosome during transcription by RNA polymerase II // Methods Enzymol. 2003. Vol. 371. P. 564–577.

10. Kulaeva O.I., Gaykalova D.A., Pestov N.A., Golovastov V.V., Vassylyev D.G., Artsimovitch I., Studitsky V.M. Mechanism of chromatin remodeling and recovery during passage of RNA polymerase II // Nat. Struct. Mol. Biol. 2009. Vol. 16. N 12. P. 1272–1278.

11. Kireeva M.L., Walter W., Tchernajenko V., Bondarenko V., Kashlev M., Studitsky V.M. Nucleosome remodeling induced by RNA polymerase II: loss of the H2A/H2B dimer during transcription // Mol. Cell. 2002. Vol. 9. N 3. P. 541–552.