ИЗМЕНЕНИЕ КОНФОРМАЦИИ ЛИНКЕРНОЙ ДНК ПРИ СВЯЗЫВАНИИ ГИСТОНА Н1.5 C НУКЛЕОСОМОЙ: ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ ОДИНОЧНЫХ КОМПЛЕКСОВ

Разработана методика синтеза флуоресцентно-меченой ДНК для сборки мононуклеосом с ДНК-линкерами длиной 40 пар нуклеотидов (п.н.). Метки Су3 и Су5 введены в линкеры на расстояниях соответственно 10 п.н. до первого и 15 п.н. после последнего нуклеотида нуклеосом-позиционирующей последовательности ДНК. В отсутствии линкерного гистона Н1.5 исследование методом флуоресцентной микроскопии одиночных комплексов выявило наличие двух равновероятных состояний нуклеосом, отличающихся конформацией ДНК-линкеров: открытой — с эффективностью переноса энергии Е между метками, равной 0,06, и закрытой — с Е = 0,37, где линкеры сближены. Связывание гистона Н1.5 с нуклеосомами происходит в наномолярном диапазоне концентраций, и скорость образования комплексов существенно выше, чем скорость их диссоциации. В комплексах происходит значительное сближение линкеров (Е = 0,73), а их конформация в области меток становится более единообразной. Разработанные нуклеосомные конструкты являются высокочувствительными флуоресцентными сенсорами для анализа структурных перестроек линкеров и в комбинации с методом микроскопии одиночных комплексов позволяют изучать структуру комплексов нуклеосом с различными архитектурными белками хроматина.

1. Shrestha D., Jenei A., Nagy P., Vereb G., Szöllősi J. Understanding FRET as a research tool for cellular studies // Int. J. Mol. Sci. 2015. Vol.16. N 4. P. 6718–6756.

2. Sustarsic M.K. Taking the ruler to the jungle: singlemolecule FRET for understanding biomolecular structure and dynamics in live cells // Curr. Opin. Struct. Biol. 2015 Vol. 18. P. 52–59.

3. Arai Y.N. Extensive use of FRET in biological imaging // Microscopy (Oxf). 2013. Vol. 62. P. 419–428.

4. Sugawa M.A., Iwane A.H., Ishii Y., Yanagida T. Single molecule FRET for the study on structural dynamics of biomolecules // Biosystems. 2007. Vol. 88. N 3. P. 243–250.

5. Lee W., Obubuafo A., Lee Y.I., Davis L.M., Soper S.A. Single-pair fluorescence resonance energy transfer (spFRET) for the high sensitivity analysis of low-abundance proteins using aptamers as molecular recognition elements // J. Fluoresc. 2010. Vol. 20. N 1. P. 203–213.

6. Gansen A., Tóth K., Schwarz N., Langowski J. Structural variability of nucleosomes detected by single-pair Förster resonance energy transfer: histone acetylation, sequence variation, and salt effects // J. Phys. Chem. B. 2009. Vol. 113. N 9. P. 2604–2613.

7. Kudryashova K.S., Chertkov O.V., Nikitin D.V., Pestov N.A., Kulaeva O.I., Efremenko A.V., Solonin A.S., Kirpichnikov M.P., Studitsky V.M., Feofanov A.V. Preparation of mononucleosomal templates for analysis of transcription with RNA polymerase using spFRET // Methods Mol. Biol. 2015. Vol. 1288. P. 395–412.

8. Ngo T.T., Ha T. Nucleosomes undergo slow spontaneous gaping // Nucleic Acids Res. 2015. Vol. 43. N 8. P. 3964– 3971.

9. Feofanov A.V., Kudryashova K.S., Chertkov O.V., Nikitin D.V., Pestov N.A., Kulaeva O.I., Studitsky V.M., Kirpichnikov M.P. Analysis of nucleosome transcription using singleparticle FRET // Springer Proc. Phys. 2015. Vol. 164. P. 255–260.

10. Ngo T.T., Zhang Q., Zhou R., Yodh J.G., Ha T. Asymmetric unwrapping of nucleosomes under tension directed by DNA local flexibility // Cell. 2015. Vol.160. N 6. P. 1135–1144.

11. Kudryashova K.S., Nikitin D.V., Chertkov O.V., Gerasimova N.S., Valieva M.E., Studitsky V.M., Feofanov A.V. Development of fluorescently labeled mononucleosomes for the investigation of transcription mechanisms by single complex microscopy // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2015. Vol. 70. N 4. P. 189–193.

12. Luo Y., North J.A., Poirier M.G. Single molecule fluorescence methodologies for investigating transcription factor binding kinetics to nucleosomes and DNA // Methods. 2014. Vol. 70. N 2–3. P. 108–118.

13. Simon M.N., Shimko J.C., Forties R.A., Ferdinand M.B., Manohar M., Zhang M., Fishel, R., Ottesen J.J., Poirier M.G. Histone fold modifications control nucleosome unwrapping and disassembly // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011. Vol. 108. N 31. P. 12711–12716.

14. Syed S.H., Goutte-Gattat D., Becker N., Meyer S., Shukla M.S., Hayes J.J., Everaers R., Angelov D., Bednar J., Dimitrov S. Single-base resolution mapping of H1-nucleosome interactions and 3D organization of the nucleosome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. Vol. 107. N 21. P. 9620–9625.

15. Meyer S. B., Syed S.H., Goutte-Gattat D., Shukla M.S., Hayes J.J., Angelov D., Bednar J., Dimitrov S., Everaers R. From crystal and NMR structures, footprints and cryo-electron- micrographs to large and soft structures: nanoscale modeling of the nucleosomal stem // Nucleic Acids Res. 2011. Vol. 39. P. 9139–9154.

16. Zhou B.R., Feng H., Kato H., Dai L., Yang Y., Zhou Y., Bai Y. Structural insights into the histone H1-nucleosome complex // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. Vol. 110. N 48. P. 19390–19395.

17. Gaykalova D.A., Kulaeva O.I., Bondarenko V.A., Studitsky V.M. Preparation and analysis of uniquely positioned mononucleosomes // Methods Mol. Biol. 2009. Vol. 523. P. 109–123.

18. Syed S.H., Goutte-Gattat D., Becker N., Meyer S., Shukla M.S., Hayes J.J., Everaers R., Angelov D., Bednar J., Dimitrov S. Single-base resolution mapping of H1-nucleosome interactions and 3D organization of the nucleosome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. Vol. 107. N 21. P. 9620–9625.

19. Meyer S., Becker N.B., Syed S.H., Goutte-Gattat D., Shukla M.S., Hayes J.J., Angelov D, Bednar J., Dimitrov S., Everaers R. From crystal and NMR structures, footprints and cryo-electron-micrographs to large and soft structures: nanoscale modeling of the nucleosomal stem // Nucleic Acids Res. 2011. Vol. 39. N 21. P. 9139–9154.

20. Song F., Chen P., Sun D., Wang M., Dong L., Liang D., Xu R.M., Zhu P., Li G. Cryo-EM study of the chromatin fiber reveals a double helix twisted by tetranucleosomal units // Science. 2014. Vol. 344. N 6182. P. 376–380.

21. Fan L., Roberts V.A. Complex of linker histone H5 with the nucleosome and its implications for chromatin packing // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. Vol. 103. N 22. P. 8384–8289.

22. Cui F., Zhurkin V.B. Distinctive sequence patterns in metazoan and yeast nucleosomes: implications for linker histone binding to AT-rich and methylated DNA // Nucleic Acids Res. 2009. Vol. 37. N 9. P. 2818–2829.

23. Zhou B.R., Jiang J., Feng H., Ghirlando R., Xiao T.S., Bai Y. Structural mechanisms of nucleosome recognition by linker histones // Mol. Cell. 2015. Vol. 59. N 4. P. 628–638.

24. Bernier M., Luo Y., Nwokelo K.C., Goodwin M., Dreher S.J., Zhang P., Parthun M.R., Fondufe-Mittendorf Y., Ottesen J.J., Poirier M.G. Linker histone H1 and H3K56 acetylation are antagonistic regulators of nucleosome dynamics // Nat. Commun. 2015. Vol. 6. P. 10152.