ЭКСПРЕСС-МЕТОД СКРИНИНГА ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ ПО ИНТЕНСИВНОСТИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ РЕПОРТЕРНОГО БЕЛКА GFP
Аннотация
Разработан экспресс-метод первичного анализа трансформированных растений по интенсивности флуоресценции зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein, GFP). По сравнению с распространенными методами скрининга трансгенных растений методами полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в реальном времени или Нозерн-гибридизации, оценка по интенсивности флуоресценции GFP предлагаемым методом не требует дорогостоящих реактивов и занимает меньше времени. Такой подход может позволить вести скрининг первичных трансгенных регенерантов, сохраняя их для дальнейшей работы. Для доказательства корректности разработанного метода соотносили экспрессию модифицированного гена GFP (hGFP) в листьях трансформированных растений картофеля сорта “Скороплодный”, определенную по накоплению мРНК, с интенсивностью флуоресценции белка GFP в микропрепаратах листьев. Высокая степень корреляции данных, полученных этими двумя методами, свидетельствует о наличии зависимости интенсивности флуоресценции от количества целевой мРНК.
Ключевые слова
GFP,
генетическая инженерия,
интенсивность флуоресценции,
картофель,
скрининг,
первичные регенеранты
Об авторах
Н. О. Юрьева
Институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН
Россия
канд. c-х. наук, ст. науч. сотр.
Россия
канд. c-х. наук, ст. науч. сотр.
А. С. Воронков
Институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН;
Государственный гуманитарно-технологический университет
Россия
канд. биол. наук, науч. cотр. Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева, РАН; доц. Государственного гуманитарно-технологического университета
Россия
канд. биол. наук, науч. cотр. Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева, РАН; доц. Государственного гуманитарно-технологического университета
Д. В. Терешонок
Институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН
Россия
канд. биол. наук, науч. сотр.
Россия
канд. биол. наук, науч. сотр.
Е. С. Осипова
Институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН
Россия
канд. биол. наук, ст. науч. сотр.
Россия
канд. биол. наук, ст. науч. сотр.
Е. В. Платонова
Институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН
Россия
мл. науч. сотр.
Россия
мл. науч. сотр.
Д. В. Беляев
Институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН
Россия
канд. биол. наук, ст. науч. сотр.
Россия
канд. биол. наук, ст. науч. сотр.
Список литературы
1. Sheen J., Hwang S., Niwa Y., Kobayashi H., Galbraith D.W. Green-fluorescent protein as a new vital marker in plant cells // Plant J. 1995. Vol. 8. N 5. P. 777–784.
2. Cubitt A.B., Heim R., Adams S.R., Boyd A.E., Gross L.A., Tsien R.Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins // Trends Biochem. Sci. 1995. Vol. 20. N 11. P. 448–455.
3. Patterson G.H., Knobel S.M., Sharif W.D., Kain S.R., Piston D.W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescent microscopy // Biophys. J. 1997. Vol. 73. N 5. P. 2782–2790.
4. Shaw S.L., Ehrhardt D.W. Smaller, faster, brighter: advances in optical imaging of living plant cells // Annu. Rev. Plant Biol. 2013. Vol. 64. P. 351–375.
5. Richards H.A., Halfhill M.D., Millwood R.J., Stewart Jr C.N. Quantitative GFP fluorescence as an indicator of recombinant protein synthesis in transgenic plants // Plant Cell Rep. 2003. Vol. 22. P. 117–121.
6. Mazur B.J., Chui C.F. Sequence of a genomic DNA clone for the small subunit of ribulose bis-phosphate carboxylase-oxygenase from tobacco // Nucleic Acids Res. 1985. Vol. 13. N 7. P. 2373–2386.
7. Zolotukhin S., Potter M., Hauswirth W.W., Guy J., Muzyczka N. A “humanized” green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells // J. Virol. 1996. Vol. 70. N 7. P. 4646–4654.
8. Юрьева Н.О., Егоров Ц.А., Беляев Д.В., Соболькова Г.И., Деревягина М.К., Рогожин Е.А., Терешонок Д.В., Мелешин А.А., Шелухин П.Г. Способ получения форм картофеля in vitro, устойчивых к возбудителям фитофтороза и альтернариоза. Патент РФ № 2524424 от 14.06.2014. Опубликовано: 27.07.2014. Бюл. № 21.
9. Murasige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. Vol. 15. N 3. P. 473–497.
10. Moller E.M., Bahnweg G., Sandermann H., Geiger H.H. A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentous fungi, fruit bodies, and infected plant tissues // Nucleic Acids Res. 1992. Vol. 20. N 22. P. 6115–6116.
11. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning. A laboratory manual N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. 545 pp.
12. Herrera-Estrella L., Van den Broeck G., Maenhaut R., Van Montagu M., Schell J., Timko M., Cashmore A. Light-inducible and chloroplast-associated expression of a chimaeric gene introduced into Nicotiana tabacum using a Ti plasmid vector // Nature. 1984. Vol. 310. N 5973. P. 115–120.
13. Chiu W., Niwa Y., Zeng W., Hirano T., Kobayashi H., Sheen J. Engineered GFP as a vital reporter in plants // J. Curr Biol. 1996. Vol. 6. N 3. P. 325–330.
14. Finer J.J., Beck S.L., Buenrostro-Nava M.T., Chi Y., Ling P.P. Monitoring gene expression in plant tissues. Using green fluorescent protein with automated image collection and analysis // Plan tissue culture engineering. Focus on biotechnology, vol 6 / Eds. S.D. Gupta and Y. Ibaraki. Dordrecht: Springer, 2006. P. 31–46.
15. Haikonen T., Rajamaki M.L., Valkonen J.P. Improved silencing suppression and enhanced heterologous protein expression are achieved using an engineered viral helper component proteinase // J. Virol. Methods. 2013. Vol. 193. N 2. P. 687–692.
16. Naylor L.H. Reporter gene technology: the future looks bright // Biochem. Pharmocol. 1999. Vol. 58. N. 5. P. 749–757.
Для цитирования:
Юрьева Н.О., Воронков А.С., Терешонок Д.В., Осипова Е.С., Платонова Е.В., Беляев Д.В. ЭКСПРЕСС-МЕТОД СКРИНИНГА ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ ПО ИНТЕНСИВНОСТИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ РЕПОРТЕРНОГО БЕЛКА GFP. Вестник Московского университета. Серия 16. Биология. 2018;73(2):85-92.
For citation:
Yuorieva N.O., Voronkov A.S., Tereshonok D.V., Osipova E.S., Platonova E.V., Belyaev D.V. AN ASSAY FOR EXPRESS SCREENING OF POTATO TRANSFORMANTS BY GFP FLUORESCENCE. Vestnik Moskovskogo universiteta. Seriya 16. Biologiya. 2018;73(2):85-92. (In Russ.)
Просмотров: 45
Послать статью по эл. почте 