Preview

Вестник Московского университета. Серия 16. Биология

Расширенный поиск
Доступ открыт Открытый доступ  Доступ закрыт Только для подписчиков

Дизайн биосенсоров нуклеиновых кислот на основе систем CRISPR/Cas и репортерных сплит-белков

Полный текст:

Аннотация

Для диагностики многих болезней человека, животных и растений, мониторинга окружающей среды необходимы высокочувствительные, специфичные, быстрые и простые в использовании диагностические методы детекции нуклеиновых кислот патогенов. Альтернативой методу полимеразной цепной реакции, который требует дорогостоящего лабораторного оборудования, являются подходы, основанные на использовании естественной способности бактериальных CRISPR/Cas9-систем к узнаванию последовательностей ДНК с высокой специфичностью в изотермических условиях. Разработка методов регистрации сигнала при образовании комплекса ДНК/РНК/Cas9-белок является отдельной биоинженерной задачей. В данной работе нами разработан дизайн и исследована применимость биосенсорной системы, основанной на связывании двух dCas9-белков с целевыми последовательностями ДНК (без их разрезания) и детекции их солокализации с помощью репортерных систем на основе сплит-ферментов. Методами молекулярного моделирования определены возможные взаимные расположения двух dCas9-белков на детектируемом локусе геномной ДНК, позволяющие оптимальным образом взаимодействовать присоединенным к ним доменам сплит-ферментов. Определены оптимальные расстояния на ДНК между сайтами связывания dCas9-белков в различной ориентации, смоделирована зависимость структуры комплекса от расстояния между сайтами связывания dCas9-белков. Методами биоинформатики проанализированы геномы ряда вирусов (включая SARS-CoV-2), показано наличие уникальных для вида геномных локусов, допускающих возможность посадки пар dCas9-белков в оптимальных положениях. Проанализирована возможность комбинированного использования dCas9-белков из различных бактерий для расширения спектра детектируемых локусов. Результаты работы свидетельствуют о принципиальной возможности создания высокоспецифичных биосенсоров нуклеиновых кислот на основе комбинации технологий CRISPR/Cas9 и сплит-ферментов.

Об авторах

Р. В. Новиков
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Научно-технологический университет «Сириус»
Россия

Новиков Роман Вячеславович – студент кафедры биоинженерии биологического факультета

119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12
354340, г. Сочи, ул. Олимпийская, д. 1
Тел.: 8-495-939-57-38



А. К. Грибкова
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Научно-технологический университет «Сириус»
Россия

Грибкова Анна Кирилловна – аспирантка кафедры биоинженерии биологического факультета

119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12
354340, г. Сочи, ул. Олимпийская, д. 1
Тел.: 8-495-939-57-38



Ю. Г. Качер
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Научно-технологический университет «Сириус»
Россия

Качер Юлия Германовна – магистр кафедры биоинженерии биологического факультета

119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12
354340, г. Сочи, ул. Олимпийская, д. 1
Тел.: 8-495-939-57-38



П. А. Зайцев
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Научно-технологический университет «Сириус»
Россия

Зайцев Петр Андреевич – аспирант кафедры биоинженерии биологического факультета

119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12
354340, г. Сочи, ул. Олимпийская, д. 1
Тел.: 8-495-939-57-38



Г. А. Армеев
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Научно-технологический университет «Сириус»
Россия

Армеев Григорий Алексеевич – канд. физ-мат. наук, ст. науч. сотр. кафедры биоинженерии биологического факультета

119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12
354340, г. Сочи, ул. Олимпийская, д. 1
Тел.: 8-495-939-57-38



Г. С. Глухов
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Научно-технологический университет «Сириус»
Россия

Глухов Григорий Сергеевич – канд. биол. наук, мл. науч. сотр. кафедры биоинженерии биологического факультета

119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12
354340, г. Сочи, ул. Олимпийская, д. 1
Тел.: 8-495-939-57-38



А. К. Шайтан
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Научно-технологический университет «Сириус»; Национальный исследовательский университет «Высшая школа экономики»
Россия

Шайтан Алексей Константинович – канд. физ-мат. наук, вед. науч. сотр. кафедры биоинженерии биологического факультета

119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12
354340, г. Сочи, ул. Олимпийская, д. 1
109028, г. Москва, Покровский бульвар, д. 11
Тел.: 8-495-939-57-38



Список литературы

1. MacKay M.J., Hooker A.C., Afshinnekoo E. et al. The COVID-19 XPRIZE and the need for scalable, fast, and widespread testing: 9 // Nat. Biotechnol. 2020. Vol. 38. N 9. P. 1021–1024.

2. Notomi T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA // Nucleic Acids Res. 2000. Vol. 28. N 12: e63.

3. Makarova K.S., Wolf Y.I., Iranzo J. et al. Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants // Nat. Rev. Microbiol. 2020. Vol. 18. N 2. P. 67–83.

4. Kellner M.J., Koob J., Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Zhang F. SHERLOCK: Nucleic acid detection with CRISPR nucleases // Nat. Protoc. 2019. Vol. 14. N 10. P. 2986–3012.

5. Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Kellner M.J., Joung J., Collins J.J., Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6 // Science. 2018. Vol. 360. N 6387. P. 439–444.

6. Lobato I.M., O’Sullivan C.K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances // TrAC Trends Anal. Chem. 2018. Vol. 98. P. 19–35.

7. Li Y., Li S., Wang J., Liu G. CRISPR/Cas systems towards next-generation biosensing // Trends Biotechnol. 2019. Vol. 37. N 7. P. 730–743.

8. Qi L.S., Larson M.H., Gilbert L.A., Doudna J.A., Weissman J.S., Arkin A.P., Lim W.A. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression // Cell. 2013. Vol. 152. N 5. P. 1173–1183.

9. Zhang L., Rube H.T., Bussemaker H.J., Pufall M.A. The effect of sequence mismatches on binding affinity and endonuclease activity are decoupled throughout the Cas9 binding site // BioRxiv. 2017: 176255.

10. Pettersen E.F., Goddard T.D., Huang C.C., Couch G.S., Greenblatt D.M., Meng E.C., Ferrin T.E. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis // J. Comput. Chem. 2004. Vol. 25. N 13. P. 1605–1612.

11. Huai C., Li G., Yao R., Zhang Y., Cao M., Kong L., Jia C., Yuan H., Chen H., Lu D., Huang Q. Structural insights into DNA cleavage activation of CRISPR-Cas9 system: 1 // Nat. Commun. 2017. Vol. 8. N 1: 1375.

12. Gowers R., Linke M., Barnoud J., Reddy T., Melo M., Seyler S., Domański J., Dotson D., Buchoux S., Kenney I., Beckstein O. MDAnalysis: A Python Package for the Rapid Analysis of Molecular Dynamics Simulations // Proceedings of the 15th Python in Science Conference. Austin: SciPy, 2016. P. 98–105.

13. Harris C.R., Millman K.J., van der Walt S.J. et al. Array programming with NumPy: 7825 // Nature. 2020. Vol. 585. N 7825. P. 357–362.

14. Hunter J.D. Matplotlib: A 2D graphics environment // Comput. Sci. Eng. 2007. Vol. 9. N 3. P. 90–95.

15. Pruitt K.D., Tatusova T., Maglott D.R. NCBI reference sequences (RefSeq): a curated non-redundant sequence database of genomes, transcripts and proteins // Nucleic Acids Res. 2007. Vol. 35. Database issue. P. D61–D65.

16. Katoh K., Rozewicki J., Yamada K.D. MAFFT online service: multiple sequence alignment, interactive sequence choice and visualization // Brief. Bioinform. 2019. Vol. 20. N 4. P. 1160–1166.

17. Wehr M.C., Rossner M.J. Split protein biosensor assays in molecular pharmacological studies // Drug Discov. Today. 2016. Vol. 21. N 3. P. 415–429.

18. Azad T., Tashakor A., Hosseinkhani S. Splitluciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives // Anal. Bioanal. Chem. 2014. Vol. 406. N 23. P. 5541–5560.

19. Porter J.R., Stains C.I., Segal D.J., Ghosh I. Split beta-lactamase sensor for the sequence-specific detection of DNA methylation // Anal. Chem. 2007. Vol. 79. N 17. P. 6702–6708.

20. Chen X., Zaro J., Shen W.-C. Fusion protein linkers: Property, design and functionality // Adv. Drug Deliv. Rev. 2013. Vol. 65. N 10. P. 1357–1369.

21. Soranno A., Longhi R., Bellini T., Buscaglia M. Kinetics of contact formation and end-to-end distance distributions of swollen disordered peptides // Biophys. J. 2009. Vol. 96. N 4. P. 1515–1528.

22. Zhao S., Lou J., Cao L., Zheng H., Chong M.K.C., Chen Z., Chan R.W.Y., Zee B.C.Y., Chan P.K.S., Wang M.H. Quantifying the transmission advantage associated with N501Y substitution of SARS-CoV-2 in the United Kingdom: An early data-driven analysis // J. Travel Med. 2021. Vol. 28. N 2: taab011.

23. Wang M., Zhang R., Li J. CRISPR/cas systems redefine nucleic acid detection: Principles and methods // Biosens. Bioelectron. 2020. Vol. 165: 112430.

24. Broughton J.P., Deng X., Yu G. et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2 // Nat. Biotechnol. 2020. Vol. 38. N 7. P. 870–874.

25. Zhou W., Hu L., Ying L., Zhao Z., Chu P.K., Yu X.-F. A CRISPR–Cas9-triggered strand displacement amplification method for ultrasensitive DNA detection: 1 // Nat. Commun. 2018. Vol. 9. N 1: 5012.

26. Wang R., Zhao X., Chen X., Qiu X., Qing G., Zhang H., Zhang L., Hu X., He Z., Zhong D., Wang Y., Luo Y. Rolling circular amplification (RCA)-Assisted CRISPR/Cas9 cleavage (RACE) for highly specific detection of multiple extracellular vesicle MicroRNAs // Anal. Chem. 2020. Vol. 92. N 2. P. 2176–2185.

27. Wang X., Xiong E., Tian T., Cheng M., Lin W., Wang H., Zhang G., Sun J., Zhou X. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9-mediated lateral flow nucleic acid assay // ACS Nano. 2020. Vol. 14. N 2. P. 2497–2508.

28. Slaymaker I.M., Gao L., Zetsche B., Scott D.A., Yan W.X., Zhang F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity // Science. 2016. Vol. 351. N 6268. P. 84–88.


Для цитирования:


Новиков Р.В., Грибкова А.К., Качер Ю.Г., Зайцев П.А., Армеев Г.А., Глухов Г.С., Шайтан А.К. Дизайн биосенсоров нуклеиновых кислот на основе систем CRISPR/Cas и репортерных сплит-белков. Вестник Московского университета. Серия 16. Биология. 2021;76(2):67-75.

For citation:


Novikov R.V., Gribkova A.K., Kacher J.G., Zaytsev P.A., Armeev G.A., Gluhov G.S., Shaytan A.K. Design of nucleic acid biosensors based on CRISPR/Cas systems and reporter split-proteins. Vestnik Moskovskogo universiteta. Seriya 16. Biologiya. 2021;76(2):67-75. (In Russ.)

Просмотров: 8


ISSN 0137-0952 (Print)