Криоконвейерные протоколы в корреляционной световой и электронной микроскопии: от многоуровневой визуализации до моделирования биофизических эффектов и «криотераностики»

Данная статья может рассматриваться как технико-методическая заметка, целью которой является внедрение в практику биологических исследований методов криомикроскопии в конвейерном режиме, начиная с малых увеличений и заканчивая пределами увеличениия/разрешения сканирующей электронной криомикроскопии (scanning electron cryomicroscopy, CryoSEM). Описываемый протокол может быть применен на образцах с малой сложностью пробоподготовки, без ультратомии и проводки, свойственной методам просвечивающей криоэлектронной микроскопии. В рамках данного протокола анализ образцов производится в единой микрокювете (чипе), последовательно перемещаемой от инструментов оптической микроскопии низкого разрешения (таких, как безлинзовые криомикроскопы) на уровень CryoSEM/CryoESEM (environmental scanning electron microscope – криоэлектронной микроскопии в программируемых средах/атмосферах). Были внедрены и апробированы методы: корреляционной безлинзовой криомикроскопии и CryoSEM (в том числе, с последовательным переходом к микроанализу на волнодисперсионном рентгеновском спектрометре на круге Роуланда); микроскопии и микроинтерферометрии в диапазонах от инфракрасного до дальнего ультрафиолетового. Преимущество протокола криоконвейерного анализа состоит в: обеспечении сохранности образца в единой переносимой кювете при возможности установления пространственной колокализации данных оптической и электронной микроскопии с использованием програмного обеспечения для распознавания образов (вплоть до индексирования в лабораторной информационной системе – laboratory information system, LIS) при проведении полного комплекса криомикроскопических изысканий. При этом предоставляется возможность обеспечения комплексного неразрушающего анализа при последовательном исследовании микроскопических систем с возможностью варьирования последующих стадий микроскопии высокого разрешения, в зависимости от результатов, полученных на предшествующих стадиях микроскопии (более низкого разрешения).

1. Holt W.V., Head M.F., North R.D. Freeze-induced membrane damage in ram spermatozoa is manifested after thawing: observations with experimental cryomicroscopy. Biol. Reprod. 1992;46(6):1086–1094.

2. Gradov O.V., Gradova M.A. Cryo-electron microscopy as a functional instrument for systems biology, structural analysis and experimental manipulations with living cells. A comprehensive analytical review of the current works. Probl. Cryobiol. Cryomed. 2014;24(3):193–211.

3. Gradov O.V., Gradova M.A. Methods of electron microscopy of biological and abiogenic structures in artificial gas atmospheres. Surf. Eng. Appl. Electrochem. 2016;52:117–125.

4. Hauptmann A., Hoelzl G., Loerting T. Optical cryomicroscopy and differential scanning calorimetry of buffer solutions containing cryoprotectants. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2021;163:127–140.

5. Stott S.L., Karlsson, J.O. Visualization of intracellular ice formation using high-speed video cryomicroscopy. Cryobiology. 2009;58(1):84–95.

6. Terada N., Ohno N., Saitoh S., Ohno S. Application of “in vivo cryotechnique” to detect erythrocyte oxygen saturation in frozen mouse tissues with confocal Raman cryomicroscopy. J. Struct. Biol. 2008;163(2):147–154.

7. Yu G., Li R., Hubel A. Raman Cryomicroscopic Imaging and Sample Holder for Spectroscopic Subzero Temperature Measurements. Cryopreservation and FreezeDrying Protocols. Methods in Molecular Biology, vol. 2180. Eds.: W.F. Wolkers and H. Oldenhof. N.Y.: Human; 2021:351–361.

8. Tanino K., Liu J., Kobayashi S., Kawamura Y., Borondics F., Uemura M. Using synchrotron FTIR and confocal cryomicroscopy to explore mechanisms of cold acclimation and freezing resistance using a single cell layer of Allium fistulosum L. Plant and Microbe Adaptations to Cold in a Changing World. Eds. R. Imai, M. Yoshida and N. Matsumoto. N.Y.: Springer; 2013:165–177.

9. Wolkers W., Diekmann U., Mueller T., Spindler R., Glasmacher B. Cryomicroscopy and FTIR studies on mouse embryonic fibroblast feeder cells during cryopreservation. Hum. Gene Ther.2009;20(11):1434.

10. König K., Uchugonova A., Breunig H.G. High-resolution multiphoton cryomicroscopy. Methods. 2014;66(2):230–236.

11. Buleon A., Bizot H., Le Bail P., Paris M., Putaux J.L. New approaches to starch structure including cryomicroscopy and synchrotron diffraction. 2001 IFT Annual Meeting (New Orleans, Louisiana, U.S.A., June 23–27, 2001). Technical Program & Book of Abstracts. Institute of Food Technologists. 2001.

12. Rousseau A., Valvin P., Desrat W., Xue L., Li J., Edgar J.H., Cassabois G., Gil B. Bernal boron nitride crystals identified by deep-ultraviolet cryomicroscopy. ACS Nano. 2022;16(2):2756–2761.

13. Valvin P., Pelini T., Cassabois G., Zobelli A., Li J., Edgar J.H., Gil B. Deep ultraviolet hyperspectral cryomicroscopy in boron nitride: Photoluminescence in crystals with an ultra-low defect density. AIP Adv.2020;10(7):075025.

14. Mehl P.M. Cryomicroscopy as a support technique for calorimetric measurements by DSC for the study of the kinetic parameters of crystallization in aqueous solutions: Part 1. Nucleation in the water-2-propanediol system. Thermochim. Acta. 1992;203:475–492.

15. Müller T., Guggenheim R., Düggelin M., Lüönd G. Online cryopreparation and cryomicroscopy in SEM with SCU 020. Electron Microscopy 1986. Proc. XIth Congr. Electron Microscopy. Ed. H. Imura, S. Maruse and T. Suzuki. Japanese Society of Electron Microscopy; 1986:2233–2234.

16. Liu Z. An integrated finite element modeling / cryomicroscopy investigation of osmotic environment and ice structure during freezing of tissues. University of Calgary (Canada). 2003. doi: 10.11575/PRISM/21558.

17. Cosman M.D., Toner M., Kandel J., Cravalho E.G. An integrated cryomicroscopy system. Cryo-Lett. 1989;10(1):17–38.

18. Katiyar N.K., Biswas K., Tiwary CS. Cryomilling as environmentally friendly synthesis route to prepare nanomaterials. Int. Mater. Rev. 2021;66(7):493–532.

19. Gradov O.V. Novel perspectives for CLEM techniques in multiparametric morphology protocols. Int. J. Biomed. 2019;9(Suppl. 1):35. https://ssrn.com/abstract=3457825

20. O’Toole E., Kremer J., McIntosh J.R. HVEM cryomicroscopy of human blood-platelets. Mol. Biol. Cell. 1992;3:A63.

21. O’Toole E., Wray G., Kremer J., McIntosh J.R. High voltage cryomicroscopy of human blood platelets. J. Struct. Biol. 1993;110(1):55–66.