IV международная конференция «Криоэлектронная микроскопия 2023: достижения и перспективы» (RICCEM-2023) прошла на биологическом факультете МГУ в гибридном (онлайн- и оффлайн-) формате и собрала более 250 исследователей из 10 стран. По итогам конференции был издан специальный выпуск журнала «Вестник Московского университета. Серия 16. Биология». В этой статье кратко обсуждаются основные результаты конференции и содержание опубликованных в спецвыпуске работ.

Обсуждается современное состояние проблемы фолдинга белков и других биополимеров. Детализируется понятие многомерной поверхности потенциальной энергии и поверхности свободной энергии для линейных полимеров с учетом топологии конфигурационного пространства и наличия элементов симметрии относительно перестановки одинаковых мономерных звеньев. Наличие кинематических связей для конформационных движений в вязкой среде приводит к тенденции формирования спиральных структур линейных полимеров. Динамические эффекты вязкости приводят также к практически равномерному распределению скоростей диссипации энергии по узлам цепи. Сочетание топографии поверхности свободной энергии и эффектов вязкости дает физическую основу для развития теории фолдинга в направлении интерпретации разнообразных экспериментальных наблюдений и выяснения принципов формирования аминокислотного кода для 3D-структур белков. Анализируется связь между температурой денатурации свернутого состояния биополимера и энергией невалентных взаимодействий между мономерами в цепи.

Пауки блуждающие, или пауки-бегуны (Ctenidae), имеют многокомпонентные яды, в которых идентифицировано более 500 различных пептидов и белков, названных ктенитоксинами. Основными компонентами яда являются цистеин-богатые пептиды, содержащие мотив ингибиторного цистинового узла (inhibitor cystine knot, ICK). Фармакологическое разнообразие ктенитоксинов позволяет рассматривать некоторые из них как прообразы для создания новых лекарств для лечения хронической боли, болезни Хантингтона, эректильной дисфункции и глаукомы. По расположению остатков цистеина в аминокислотной последовательности ктенитоксины разделяют на 14 групп, содержащих от шести до 14 остатков Cys. В настоящее время определена пространственная структура только одного ктенитоксина ω-CNTX-Pn4a (Phα1β или Tx3-6) бразильского странствующего паука Phoneutria nigriventer. Еще 10 структурных групп ктенитоксинов имеют гомологию с известными пространственными структурами токсинов пауков других семейств и других белков, а для трех групп структурные гомологи неизвестны. В данной работе предложены возможные схемы формирования дисульфидных связей для всех групп ктенитоксинов. Сравнение полученных схем с предсказаниями программы AlphaFold 2.0 показывает, что эта нейронная сеть не всегда корректно предсказывает структуры цистеин-богатых пептидов, особенно если моделируются структуры зрелых молекул без лидерных последовательностей.

Методы криоэлектронной микроскопии незаменимы в области структурных исследований оболочечных вирусов – опасных патогенов человека и животных, но требуют высокоспециализированного оборудования, а также тщательной пробоподготовки. В настоящей работе использованы возможности просвечивающего электронного микроскопа JEOL JEM-2100, дополненного скрининговым держателем, и представлены предварительные данные криоэлектронной микроскопии для штаммов вирусов гриппа A и B, а также SARS-CoV-2, инактивированного бета-пропиолактоном. Анализ изображений позволяет: (1) отличить «пустые» вирусные частицы от «полных» (содержащих нуклеокапсид); (2) визуализовать липидный бислой оболочки вириона; (3) у вирионов вируса гриппа идентифицировать поверхностные антигены и слой белка М1 в комплексе с внутренним монослоем липидной мембраны; (4) различить S-шипы разной морфологии на поверхности инактивированных вирионов SARS-CoV-2. Разработанный подход обеспечивает хорошее качество изображений для исследований как фундаментального, так и прикладного характера.

Разработан бездетергентный протокол очистки префузионного S-белка коронавируса с использованием сополимера стирола и малеиновой кислоты (styrene maleic anhydride, SMA). Экспрессия S-белка осуществлялась в клетках HEK293T. Для очистки и подготовки к микроскопированию S-белка использовали два способа солюбилизации: в детергенте NP-40 и в составе SMA. Полученные препараты были исследованы в электронном микроскопе, частицы очищенных S-белков были классифицированы. Анализ двумерных проекций частиц показал, что применение липодисков для солюбилизации приводит к меньшей подвижности очищенного белка на подложке, по сравнению с белком в детергенте, что в дальнейшем может способствовать получению более высоких разрешений при изучении структуры мембранных белков.

В работе получены пленки и скаффолды из поли-3-оксибутирата с различной микроструктурой тремя различными методами. Методом электроформования получены скаффолды с ориентированными и хаотично переплетенными волокнами различной толщины в зависимости от используемых параметров. Методами спин-коутинга и самоорганизации получены пленки с различной микроструктурой поверхности, в том числе с ориентированными элементами топографии. Показано, что микроструктура поверхности не влияет на рост мезенхимальных стволовых клеток в течение недели, однако оказывает влияние на морфологию прикрепленных клеток.

В этой работе были подобраны условия для получения образца эукариотического шаперонина TRiC, пригодного для изучения методом криоэлектронной микроскопии. С помощью метода дифференциальной сканирующей (время-разрешенной) флуориметрии была охарактеризована температурная стабильность образцов белка при разных концентрациях соли и глицерина, а затем выбранные условия использовались для подготовки образца для микроскопии. В результате съемки и обработки изображений получена структура бычьего TRiC в открытой конформации с разрешением 4,42 Å.

Candida auris – патогенный грибок, вызывающий инфекции у людей с ослабленной иммунной системой. Он устойчив к антимикробным препаратам, что усложняет лечение. C. auris представляет серьезную угрозу для здоровья населения, так как имеет высокую резистентность и контагиозность. Поскольку рибосома играет ключевую роль в жизнедеятельности организмов, поиск ингибиторов рибосомы C. auris имеет большое практическое значение. Мы использовали криоэлектронную микроскопию и анализ отдельных частиц для получения трехмерной структуры рибосомы C. auris. Мы описываем особенности рибосомальной РНК C. auris, что предоставляет ценную информацию для разработки лекарственных средств для борьбы с данным патогеном.

Продемонстрирован пример успешной модернизации аналитического просвечивающего электронного микроскопа JEOL JEM-2100 до криоэлектронного микроскопа низкого разрешения, предназначенного для решения задач отработки пробоподготовки и оценки качества препарата. В результате модернизации прибор позволяет получать субнанометровое разрешение реконструкций белковых молекул (в пределах 8 Å). Обсуждается влияние подложек из графена и аморфного углерода для предотвращения эффекта преимущественной ориентации белковых частиц в замороженном образце.

Данная статья может рассматриваться как технико-методическая заметка, целью которой является внедрение в практику биологических исследований методов криомикроскопии в конвейерном режиме, начиная с малых увеличений и заканчивая пределами увеличениия/разрешения сканирующей электронной криомикроскопии (scanning electron cryomicroscopy, CryoSEM). Описываемый протокол может быть применен на образцах с малой сложностью пробоподготовки, без ультратомии и проводки, свойственной методам просвечивающей криоэлектронной микроскопии. В рамках данного протокола анализ образцов производится в единой микрокювете (чипе), последовательно перемещаемой от инструментов оптической микроскопии низкого разрешения (таких, как безлинзовые криомикроскопы) на уровень CryoSEM/CryoESEM (environmental scanning electron microscope – криоэлектронной микроскопии в программируемых средах/атмосферах). Были внедрены и апробированы методы: корреляционной безлинзовой криомикроскопии и CryoSEM (в том числе, с последовательным переходом к микроанализу на волнодисперсионном рентгеновском спектрометре на круге Роуланда); микроскопии и микроинтерферометрии в диапазонах от инфракрасного до дальнего ультрафиолетового. Преимущество протокола криоконвейерного анализа состоит в: обеспечении сохранности образца в единой переносимой кювете при возможности установления пространственной колокализации данных оптической и электронной микроскопии с использованием програмного обеспечения для распознавания образов (вплоть до индексирования в лабораторной информационной системе – laboratory information system, LIS) при проведении полного комплекса криомикроскопических изысканий. При этом предоставляется возможность обеспечения комплексного неразрушающего анализа при последовательном исследовании микроскопических систем с возможностью варьирования последующих стадий микроскопии высокого разрешения, в зависимости от результатов, полученных на предшествующих стадиях микроскопии (более низкого разрешения).

Исследованы реологические свойства гидрогелей природного полисахарида альгината натрия при наполнении матрицы нанотрубками глины галлуазита в малых концентрациях. Выявлены изменения реологических свойств при переходе от полуразбавленного раствора полимера к гидрогелю при сшивании ионами кальция. В состоянии геля образцы обладают пределом текучести, и их вязкость при течении падает при увеличении скорости сдвига, но реологические свойства достаточно быстро восстанавливаются после снятия нагрузки. Обнаружено, что добавление до 0,3 об.% нанотрубок природной глины галлуазита приводит к увеличению модуля упругости и предела текучести гидрогеля в несколько раз, но при этом сохраняются практически важные свойства псевдопластичности и быстрого восстановления свойств после снятия нагрузки, что делает нанокомпозитные гидрогели альгината и нанотрубок галлуазита перспективными для применения в качестве чернил для экструзионной 3D-печати.