Мембранно-ассоциированные везикулы: подходы к выделению и характеризации

Межклеточная коммуникация является критически важной составляющей поддержания гомеостаза ткани. Одним из способов коммуникации является перенос широкого спектра биологически активных молекул – белков, нуклеиновых кислот (в первую очередь, некодирующих РНК) и липидов – в составе внеклеточных везикул (ВВ). Это позволяет клеткам-продуцентам ВВ изменять метаболическую и транскрипционную активность отдельных популяций клеток-мишеней в широком диапазоне и «настраивать» ее в соответствии с потребностями ткани. Большинство имеющихся работ сконцентрированы на изучении состава и функций секретируемых во внешнюю среду ВВ, тогда как изучение подкласса везикул, ассоциированного с мембраной (мембранно-ассоциированные везикулы, МАВ) затрудняется из-за отсутствия общепринятых методов их выделения из разных типов клеток, в том числе культивируемых, и характеристики. В данной работе мы приводим протокол, позволяющий выделять фракцию МАВ культивируемых мезенхимных стромальных/стволовых клеток с сохранением морфологии и жизнеспособности самих клеток с помощью обработки гиалуронидазой. Данный протокол показал наиболее высокую эффективность по сравнению с другими протестированными методами и позволяет получить фракцию, значимо обогащенную везикулами, что показано методами анализа траекторий наночастиц и просвечивающей электронной микроскопии. Проведенный сравнительный анализ характеристик МАВ и ВВ, секретируемых в среду, показал, что предлагаемый протокол выделения МАВ позволяет получить фракцию со сходной концентрацией частиц, однако они обладают меньшим размером по сравнению с ВВ. Таким образом описанный нами метод выделения позволяет получить фракцию МАВ для дальнейшего анализа их состава и функциональных особенностей.

1. Williams T., Salmanian G., Burns M., Maldonado V., Smith E., Porter R.M., Song Y.H., Samsonraj R.M. Versatility of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in tissue repair and regenerative applications. Biochimie. 2023;207:33–48.

2. van Griensven M., Balmayor E.R. Extracellular vesicles are key players in mesenchymal stem cells’ dual potential to regenerate and modulate the immune system. Adv. Drug Deliv. Rev. 2024:115203.

3. Manzoor T., Saleem A., Farooq N., Dar L.A., Nazir J., Saleem S., Ismail S., Gugjoo M.B., Shiekh P.A. Extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells – a novel therapeutic tool in infectious diseases. Inflamm. Regener. 2023;43(1):17.

4. Welsh J.A., Goberdhan D.C.I., O’Driscoll L., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J. Extracell. Vesicles. 2024;13(2):e12404.

5. Zhou Y., Qin Y., Sun C., Liu K., Zhang W., Gaman M.A., Chen Y. Cell-bound membrane vesicles contain antioxidative proteins and probably have an antioxidative function in cells or a therapeutic potential. J. Drug Delivery Sci. Technol. 2023;81:104240.

6. Моисеенко А.В., Басалова Н.А., Багров Д.В., Трифонова Т.С., Виговский М.А., Дьячкова У.Д., Григорьева О.А., Новоселецкая Е.С., Ефименко А.Ю., Соколова О.С. Прямая визуализация внеклеточных везикул на мембране мезенхимных стволовых/стромальных клеток человека методом криоэлектронной микроскопии. Наноиндустрия. 2024;14(7–8):434–443.

7. Konoshenko, Zamakhov I.M., Anashkin V.A., Moiseenko A.V., Orlov V.N., Vorobyeva N.N., Sokolova O.S., Baykov A.A. The structure and nucleotide-binding characteristics of regulated cystathionine β-synthase domain-containing pyrophosphatase without one catalytic domain. Int. J. Mol. Sci. 2023;24(24):17160.

8. Tang Q., Zhang X., Zhang W., Zhao S., Chen Y. Identification and characterization of cell-bound membrane vesicles. Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 2017;1859(5):756–766.

9. Zhang Y., Liu Y., Zhang W., Tang Q., Zhou Y., Li Y., Rong T., Wang H., Chen Y. Isolated cell-bound membrane vesicles (CBMVs) as a novel class of drug nanocarriers. J. Nanobiotechnol. 2020;18(1):69.

10. Tamkovich S., Tutanov O., Efimenko A., Grigoreva A., Ryabchikova E., Kirushina N., Vlassov V., Tkachuk V., Laktionov P. Blood circulating exosomes contain distinguishable fractions of free and cell-surface-associated vesicles. Curr. Mol. Med. 2019;19(4):273–285.

11. Petrova T., Kalinina O., Aquino A., Grigoryev E., Dubashynskaya N.V., Zubkova K., Kostareva A., Golovkin A. Topographic distribution of miRNAs (miR-30a, miR-223, miR-let-7a, miR-let-7f, miR-451, and miR-486) in the plasma extracellular vesicles. ncRNA. 2024;10(1):15.

12. Rilla K., Siiskonen H., Tammi M., Tammi R. Hyaluronan- coated extracellular vesicles—a novel link between hyaluronan and cancer. Adv. Cancer Res. 2014:121–148.

13. Ragni E., Perucca Orfei C., De Luca P., Lugano G., Viganò M., Colombini A., Valli F., Zacchetti D., Bollati V., de Girolamo L. Interaction with hyaluronan matrix and miRNA cargo as contributors for in vitro potential of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of human osteoarthritic synoviocytes. Stem Cell Res. Ther. 2019;10(1):109.

14. Härkönen K., Oikari S., Kyykallio H., Capra J., Hakkola S., Ketola K., Thanigai Arasu U., Daaboul G., Malloy A., Oliveira C., Jokelainen O., Sironen R., Hartikainen J.M., Rilla K. CD44s assembles hyaluronan coat on filopodia and extracellular vesicles and induces tumorigenicity of MKN74 gastric carcinoma. Cells. 2019;8(3):276.

15. Basalova N., Sagaradze G., Arbatskiy M., Evtushenko E., Kulebyakin K., Grigorieva O., Akopyan Z., Kalinina N., Efimenko A. Secretome of mesenchymal stromal cells prevents myofibroblasts differentiation by transferring fibrosis-associated microRNAs within extracellular vesicles. Cells. 2020;9(5):1272.