С 8 по 11 июня 2025 г. на биологическом факультете МГУ имени М.В. Ломоносова прошла 5-я Российская международная конференция «Криоэлектронная микроскопия 2025: достижения и перспективы» (RICCEM-2025). Более 300 исследователей из 11 стран приняли в ней участие в онлайн- и оффлайн-формате. В этой статье кратко обсуждается содержание статей специального выпуска журнала «Вестник Московского университета. Серия 16. Биология», опубликованного по итогам конференции.

Микротрубочки являются базовыми элементами цитоскелета эукариотических клеток. Благодаря своей многофункциональности, уникальной структуре и высокой механической жесткости, они остаются излюбленным объектом исследований с использованием различных методов микроскопии, включая криоэлектронную. Несмотря на впечатляющие успехи в визуализации решетки микротрубочек, гибкие элементы их структуры – отдельные протофиламенты на собирающихся или разбирающихся плюс-концах, а также регуляторные неструктурированные пептиды, известные как C-концевые «хвосты», – до сих пор слабо поддаются визуализации. В этой статье мы обсуждаем прогресс в применении криоэлектронной микроскопии и томографии к изучению этих участков, а также роль и потенциал методов молекулярного моделирования для анализа и интерпретации полученных экспериментальных данных.

Прогресс в фундаментальных исследованиях напрямую связан с появлением новых методов, которые не просто расширяют устоявшиеся классические представления, но могут дать информацию, меняющую их принципиально. По нашим данным, виментиновые филаменты, связываясь с митохондриями, определяют их распределение и подвижность в клетках, а также влияют на уровень их мембранного потенциала. Кроме того, в N-концевой части молекулы виментина имеется область, отвечающая за взаимодействие виментиновых филаментов с митохондриями, а схожие аминокислотные последовательности обнаружены и в других белках. Поскольку уже было показано прямое взаимодействие филаментов виментина с микротрубочками и филаментами актина, эти факты в совокупности позволили нам предположить, что связь отдельных компонентов цитоскелета друг с другом и с митохондриями не ограничивается взаимодействием через сшивающие и моторные белки. Виментин (а возможно, и другие белки промежуточных филаментов) может регулировать взаимодействие цитоскелета с митохондриями. Инновационное исследование, выполненное с использованием криоэлектронной томографии, принципиально изменившее наши представления о трехмерной структуре фила- ментов виментина, побудило нас использовать возможности метода криоэлектронной микроскопии, чтобы попытаться идентифицировать сайты связывания виментина с другими компонентами цитоскелета и митохондриями. Решить эту задачу принципиально возможно, если объединить микроскопию сверхвысокого разрешения и криоэлектронную томографию, что позволит преодолеть существующий «разрыв разрешения» и решить сопутствующие проблемы.

Внеклеточные везикулы эритроцитарного происхождения (ЭВ) являются перспективным средством «адресной доставки лекарств», в связи с чем целью работы стало сравнение ряда методов получения ЭВ из эритроцитов in vitro. С помощью сканирующей электронной микроскопии установлено, что при ряде воздействий (кальциевый ионофор A23187, додецилсульфат натрия, лизофосфатидная кислота и инкубация при 50°C) эритроциты отщепляют ЭВ. Различие в морфологии эритроцитов, подвергнутых воздействиям, стимулирующим выделение ЭВ, указывает на различие механизмов формирования ЭВ. Методом спектроскопии комбинационного рассеяния показано, что ЭВ, полученные методом термической обработки, могут содержать гемоглобин, в то время как при воздействии додецилсульфата натрия образуются везикулы без гемоглобина. Полученные данные позволят целенаправленно выбирать метод получения ЭВ в соответствии с требованиями к их составу.

Межклеточная коммуникация является критически важной составляющей поддержания гомеостаза ткани. Одним из способов коммуникации является перенос широкого спектра биологически активных молекул – белков, нуклеиновых кислот (в первую очередь, некодирующих РНК) и липидов – в составе внеклеточных везикул (ВВ). Это позволяет клеткам-продуцентам ВВ изменять метаболическую и транскрипционную активность отдельных популяций клеток-мишеней в широком диапазоне и «настраивать» ее в соответствии с потребностями ткани. Большинство имеющихся работ сконцентрированы на изучении состава и функций секретируемых во внешнюю среду ВВ, тогда как изучение подкласса везикул, ассоциированного с мембраной (мембранно-ассоциированные везикулы, МАВ) затрудняется из-за отсутствия общепринятых методов их выделения из разных типов клеток, в том числе культивируемых, и характеристики. В данной работе мы приводим протокол, позволяющий выделять фракцию МАВ культивируемых мезенхимных стромальных/стволовых клеток с сохранением морфологии и жизнеспособности самих клеток с помощью обработки гиалуронидазой. Данный протокол показал наиболее высокую эффективность по сравнению с другими протестированными методами и позволяет получить фракцию, значимо обогащенную везикулами, что показано методами анализа траекторий наночастиц и просвечивающей электронной микроскопии. Проведенный сравнительный анализ характеристик МАВ и ВВ, секретируемых в среду, показал, что предлагаемый протокол выделения МАВ позволяет получить фракцию со сходной концентрацией частиц, однако они обладают меньшим размером по сравнению с ВВ. Таким образом описанный нами метод выделения позволяет получить фракцию МАВ для дальнейшего анализа их состава и функциональных особенностей.

В рамках данного исследования была создана компьютерная программа Veronica – специализированная среда для разметки изображений, полученных методом криоэлектронной микроскопии. Она позволяет выделять контуры замкнутых и незамкнутых объектов и сохранять их в удобном для анализа формате, а также определять заданные метрики для исследования морфологии. С помощью программы Veronica была охарактеризована морфология образцов малых внеклеточных везикул, выделенных из желудочного сока пациентов с аденокарциномой желудка, а также условно здоровых доноров. Предложен подход к разметке изображений и расчета показателей для описания везикул, основанный на измерении параметров вложенности (меры количества частиц, вложенных друг в друга) и ветвистости (меры количества расположенных рядом частиц, окруженных общей мембраной).

Активируемый кальцием калиевый канал промежуточной проводимости K_Ca3.1 способствует Ca²⁺-зависимой гиперполяризации клеточной мембраны, а нарушения его работы наблюдаются при аутоиммунных и онкологических заболеваниях. Для изучения этого канала и его пептидных блокаторов с использованием флуоресцентного анализа были сконструированы плазмиды, кодирующие α-субъединицу K_Ca3.1, слитую с флуоресцентным белком mKate2 на N- или C-конце, а также получен флуоресцентный лиганд ChTxGFP, объединяющий в себе пептидный блокатор харибдотоксин и зеленый флуоресцентный белок. Установлено, что mKate2 на N-конце α-субъединицы блокирует перенос канала в плазматическую мембрану клеток Neuro-2а, тогда как mKate2 на ее С-конце не препятствует эффективному накоплению канала в плазматической мембране и формированию его правильной тетрамерной структуры, способной связывать пептидные блокаторы. Лиганд ChTx-GFP связывается на мембране с каналом K_Ca3.1 при концентрации 20 нМ и может быть использован для флуоресцентного имиджинга этих каналов в клетках млекопитающих.

Генетический материал клетки в интерфазном ядре представлен в виде плотной ДНК-белковой структуры, называемой хроматином. Строение и динамика отдельных нуклеосом, представляющих собой первый уровень компактизации ДНК, в настоящее время хорошо изучена, тогда как сведения о структурно-функциональной организации более высоких уровней организации хроматина все еще ограничены. В настоящей работе предложен метод визуализации полинуклеосомных конструкций при помощи атомно-силовой микроскопии. Продемонстрирована сборка полинуклеосом на плазмиде с применением октамеров рекомбинантных гистонов. Установлено, что при применении глутарового альдегида для фиксации препарата перед нанесением на подложку, нуклеосомы сохраняются, а их ширина и высота хорошо соответствует литературным данным. При этом сами плазмиды выглядят расправленными, что может помочь в изучении ДНК-белковых взаимодействий.

Транскрипция в клетке осуществляется специализированными ферментами – РНК-полимеразами. РНК-полимеразы транскрибируют ДНК с образованием элонгационных комплексов (ЭК), в том числе участвующих в регуляции транскрипции. Криоэлектронная микроскопия (криоЭМ) позволяет определять структуры этих комплексов и выяснять механизмы транскрипции хроматина. Однако подготовка образцов ЭК, пригодных для изучения методом криоЭМ, представляет определенные сложности. В данной работе проведена разработка протоколов для подготовки образов ЭК с положением активного центра РНКП в позиции +39 от входа в нуклеосому (ЭК+39). Образование комплексов подтверждалось методами электрофореза и электронной микроскопии негативного контрастирования. Разработанные методы могут быть использованы для изучения ЭК+39 методом криоЭМ.

Хроматин эукариот представляет собой высокоорганизованную и динамичную структуру, состоящую из ДНК и ассоциированных белков. Эти белки обеспечивают точную регуляцию ключевых процессов, включая экспрессию генов, репликацию и репарацию ДНК. Важнейшими регуляторами архитектуры хроматина из негистоновых белков, являются p53 и PARP1, которые участвуют в ответе клетки на повреждения ДНК. В настоящей работе проведено исследование кооперативного и конкурентного связывания ДНК-связывающего домена (DBD, DNA-Binding Domain) белка p53, и фермента PARP1 с мононуклеосомами, реконструированными на основе последовательности Widom 603 с встроенным сайтом связывания p53. Для детекции взаимодействий использован метод электрофоретического сдвига подвижности (EMSA, Electrophoretic Mobility Shift Assay) с флуоресцентно меченными нуклеосомами. Комплексы формировали двумя способами: предварительно инкубировали нуклеосомы с p53 DBD и затем добавляли PARP1, либо сначала получали комплекс нуклеосома–PARP1 и затем вносили p53 DBD. Результаты показали, что порядок добавления белков определяет характер их взаимодействия с нуклеосомой: при низких концентрациях p53 наблюдается вытеснение этого белка PARP1, тогда как при повышении концентрации p53 формируются стабильные комплексы нуклеосома–p53, не нарушенные белком PARP1. Стабильных тройных комплексов нуклеосома–p53–PARP1 не обнаружено.

В исследовании была создана платформа для флуоресцентной микроскопии, которая позволяет в режиме реального времени визуализировать динамику взаимодействия лиганда с белками, помеченными His-tag, связывающимися с Ni2+ на NTA-агарозных шариках. Эта методология преодолевает критические ограничения традиционных методов, таких как поверхностный плазмонный резонанс или гель-электрофорез, за счет сохранения кинетики фазы раствора и обеспечения субминутного временного разрешения в физиологических буферах. Мы применили эту платформу для исследования действия ингибиторов в системе нуклеосом, которая является более физиологически подходящей моделью, чем свободная ДНК. Изучая взаимодействия PARP2 с нуклеосомами в присутствии и в отсутствие клинических ингибиторов (талазопариба и велипариба), а также реакцию поли(АДФ-рибозил)ирования в присутствии НАД+, мы смогли продемонстрировать прямое пространственное и временное разрешение динамики хроматин-белок. Практически неограниченная совместимость платформы с буферами, возможность мониторинга в режиме реального времени и устранение артефактов ковалентной иммобилизации обеспечивают новое понимание механизмов взаимодействия лекарственных средств и хроматина.

PARP3 (Poly(ADP-ribose) polymerase 3), наряду с другими членами семейства PARP – PARP1 и PARP2, является важным фактором репарации ДНК. Специфические функции и молекулярные механизмы действия этого белка изучены недостаточно. Разработка надежного протокола получения PARP3 с высокой чистотой и выходом представляет собой необходимое условие для всестороннего анализа белка, в том числе изучения его связывания с ДНК, ферментативной активности, взаимодействий с другими белковыми факторами, а также структурных исследований. В данной работе представлен модифицированный протокол экспрессии белка PARP3 человека в клетках Escherichia coli и его последующей очистки, позволяющий существенно увеличить выход белка по сравнению с ранее опубликованными методиками.

Каротиноид-белковые комплексы участвуют в процессах фотосинтеза, фоторецепции, защиты от окислительного стресса, обмена веществ и пигментации. В данной работе проведен детальный анализ доступных структурных данных с атомарным разрешением каротиноид-содержащих белков. В ходе исследования проанализированы молекулярные особенности каротиноид-связывающих областей белков и структурные особенности связанных каротиноидов. Полученные результаты указывают на общие принципы организации белок-каротиноидных взаимодействий, необходимые для разработки новых подходов к их направленной модификации. Методом машинного обучения создана модель для прогноза каротиноид-связывающей активности по первичной структуре белка.

Преинициаторные рибосомные комплексы, состоящие из 40S субчастицы рибосомы и связанных с ней факторов инициации, являются стандартными компонентами цито плазмы эукариотических клеток и участвуют в связывании мРНК. Формирование таких комплексов в простейших и в клетках млекопитающих изучалось очень активно, в том числе структурными методами. В данной работе с помощью метода криоэлектронной микроскопии одиночных частиц мы изучили структуру преинициаторных комплексов, выделенных из экстрактов зародышей пшеницы. Было показано, что в экстракте около 29% свободных 40S субчастиц образуют комплекс с факторами инициации 3 и 1A. Была получена карта электронной плотности комплекса со средним разрешением 3 Å, что является первыми известными данными о структуре инициаторных комплексов растений. Была построена предварительная атомная модель фактора инициации eIF3, связанного с 40S субчастицей рибосомы (как ядра, так и дистальных субъединиц) и выявлены заметные структурные отличия от комплексов, выделенных из клеток млекопитающих.

Методом криоэлектронной микроскопии была изучена структура осевой фибриллы gp56, части адсорбционного аппарата Stx-конвертирующего фага phi24B. Осевая фибрилла обладает значительной подвижностью, тример gp56 окружен массивным комплексом гексамерного белка сопла gp57, что создает интерфейс несовпадения симметрий и затрудняет построение трехмерной реконструкции. С применением подхода расширения симметрии и локального уточнения ориентаций была получена карта рассеивающего потенциала для осевой фибриллы, визуализирована третичная структура ее глобулярных доменов и определено их расположение относительно белков адсорбционного аппарата phi24B.

Одним из традиционных подходов к созданию живых аттенуированных вакцин является холодовая адаптация вируса с получением температурочувствительных (ts) мутантов. В настоящей работе мы исследовали морфологические особенности и антигенные свойства ослабленного ts-мутанта F-F3 SARS-CoV-2 в сравнении с родительским штаммом FEB2 (Omicron BA.5.2). Просвечивающая электронная микроскопия вируса, инактивированного ультрафиолетовым облучением, не выявила существенных различий в морфологии негативно контрастированных вирусных частиц и S-спайков: вокруг вирионов обнаружена характерная «корона», состоящая из шипов в нативной префузионной кон формации. Криоэлектронная микроскопия родительского штамма подтвердила присутствие S-спайков в префузионной конформации, в то время как ts-мутанта не исследовали данным методом в связи с недостаточной концентрацией вирионов. Инкубация с иммунными сыворотками против омикрон-подобного штамма выявила образование иммунных комплексов как в случае родительского штамма, так и ts-мутанта. Атомно-силовая микроскопия позволила предположить наличие в препарате единичных вирионов, но не выявила характерной «короны» вокруг них. Это может быть связано с хрупкостью S-спайков, разрушаемых в процессе пробоподготовки, либо с маскирующим эффектом агрегатов сывороточного альбумина из культуральной клеточной среды.

Шаперон гистонов FACT играет ключевую роль в реорганизации хроматина, обеспечивая АТФ-независимое разворачивание нуклеосом. В состав комплекса yFACT дрожжей входят субъединицы Spt16 и Pob3, образующие гетеродимер, функционально ассоциированный с негистоновым белком Nhp6. В данной работе методом просвечивающей электронной микроскопии с негативным контрастированием изучали взаимодействие с нуклеосомой в присутствии Nhp6 комплекса yFACT, содержащего субъединицу Pob3 с удаленным С-концевым доменом (CTD, C-Terminal Domain). В результате удаления CTD эффективность связывания yFACT с нуклеосомой снизилась в два раза и способность к полноценному разворачиванию нуклеосом нарушилась: вместо характерных для дикого типа yFACT почти симметричных, полностью развернутых структур наблюдались асимметричные, частично развернутые. Полученные данные свидетельствуют о ключевой роли CTD Pob3 в обеспечении связывания FACT с нуклеосомой, что важно для понимания механизмов ремоделирования хроматина и регуляции транскрипции.

КЭТ (криоэлектронная томография) представляет собой мощный инструмент для изучения структуры биологических объектов в их нативном состоянии. Однако КЭТ до сих пор не получила широкого распространения для изучения клеточных органелл in situ, включая клеточное ядро и хроматин. В нашей работе мы стремились исследовать возможности применения КЭТ для изучения архитектуры хроматина, сосредоточив внимание на возможности использования метода криокорреляционной световой и электрон ной микроскопии для выбора областей интереса, а именно локусов гетерохроматина, при изготовлении ламелей с помощью травления фокусированным ионным пучком (ФИП).