N- или C-концевое положение флуоресцентного белка mKate2 в составе химеры mKate2-KCa3.1 влияет на мембранную экспрессию канала

Активируемый кальцием калиевый канал промежуточной проводимости K_Ca3.1 способствует Ca²⁺-зависимой гиперполяризации клеточной мембраны, а нарушения его работы наблюдаются при аутоиммунных и онкологических заболеваниях. Для изучения этого канала и его пептидных блокаторов с использованием флуоресцентного анализа были сконструированы плазмиды, кодирующие α-субъединицу K_Ca3.1, слитую с флуоресцентным белком mKate2 на N- или C-конце, а также получен флуоресцентный лиганд ChTxGFP, объединяющий в себе пептидный блокатор харибдотоксин и зеленый флуоресцентный белок. Установлено, что mKate2 на N-конце α-субъединицы блокирует перенос канала в плазматическую мембрану клеток Neuro-2а, тогда как mKate2 на ее С-конце не препятствует эффективному накоплению канала в плазматической мембране и формированию его правильной тетрамерной структуры, способной связывать пептидные блокаторы. Лиганд ChTx-GFP связывается на мембране с каналом K_Ca3.1 при концентрации 20 нМ и может быть использован для флуоресцентного имиджинга этих каналов в клетках млекопитающих.

1. Orfali R., Albanyan N. Ca2+-sensitive potassium channels. Molecules. 2023; 28(2):885.

2. Ghanshani S., Wulff H., Miller M.J., Rohm H., Neben A., Gutman G.A., Cahalan M.D., Chandy K.G. Up-regulation of the IKCa1 potassium channel during T-cell activation: molecular mechanism and functional consequences. J. Biol. Chem. 2000;275(47):37137–37149.

3. Calderón Artavia C.G., Arvelo Álvarez F.A. Kca3.1- related cellular signalling involved in cancer proliferation. Cell. Physiol. Biochem. Int. J. Exp. Cell. Physiol. Biochem. Pharmacol. 2024;58(2):107–127.

4. Cahalan M.D., Chandy K.G. The functional network of ion channels in T lymphocytes. Immunol. Rev. 2009;231(1):59–87.

5. Deutsch C., Chen L.Q. Heterologous expression of specific K+ channels in T lymphocytes: functional consequences for volume regulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993;90(21):10036–10040.

6. Cruse G., Duffy S.M., Brightling C.E., Bradding P. Functional KCa3.1 K+ channels are required for human lung mast cell migration. Thorax. 2006;61(10):880–885.

7. Szabò I., Zoratti M., Gulbins E. Contribution of voltage-gated potassium channels to the regulation of apoptosis. FEBS Lett. 2010;584(10):2049–2056. 8. Chou C.C., Lunn C.A., Murgolo N.J. KCa3.1: target and marker for cancer, autoimmune disorder and vascular inflammation? Expert Rev. Mol. Diagn. 2008;8(2):179–187.

8. Brown B.M., Shim H., Christophersen P., Wulff H. Pharmacology of small-and intermediate-conductance calcium-activated potassium channels. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2020;60(1):219–240.

9. Visan V., Sabatier J.M., Grissmer S. Block of maurotoxin and charybdotoxin on human intermediate-conductance calcium-activated potassium channels (hIKCa1). Toxicon. 2004;43(8):973–980.

10. Pimentel C., M’Barek S., Visan V., Grissmer S., Sampieri F., Sabatier J.M., Darbon H., Fajloun Z. Chemical synthesis and 1H-NMR 3D structure determination of AgTx2-MTX chimera, a new potential blocker for Kv1.2 channel, derived from MTX and AgTx2 scorpion toxins. Protein Sci. 2008;17(1):107–118.

11. M’Barek S., Chagot B., Andreotti N., Visan V., Mansuelle P., Grissmer S., Marrakchi M., El Ayeb M., Sampieri F., Darbon H., Fajloun Z., De Waard M., Sabatier J.M. Increasing the molecular contacts between maurotoxin and Kv1.2 channel augments ligand affinity. Proteins Struct. Funct. Bioinforma. 2005;60(3):401–411.

12. Rauer H., Lanigan M.D., Pennington M.W., Aiyar J., Ghanshani S., Cahalan M.D., Norton R.S., Chandy K.G. Structure-guided transformation of charybdotoxin yields an analog that selectively targets Ca2+-activated over voltage-gated K+ channels. J. Biol. Chem. 2000;275(2):1201–1208.

13. Bal N.V., Oblasov I., Ierusalimsky V.N., Shvadchenko A.M., Fortygina P., Idzhilova O.S., Borodinova A.A., Balaban P.M., Feofanov A.V., Nekrasova O.V., Nikitin E.S. Potassium KCa3.1 channel overexpression deteriorates functionality and availability of channels at the outer cellular membrane. Sci. Rep. 2025;15(1):4928.

14. Primak A.L., Orlov N.A., Peigneur S., Tytgat J., Ignatova A.A., Denisova K.R., Yakimov S.A., Kirpichnikov M.P., Nekrasova O.V., Feofanov A.V. AgTx2-GFP, fluorescent blocker targeting pharmacologically important Kv1.x (x = 1, 3, 6) channels. Toxins. 2023;15(3):229.

15. Ignatova A.A., Kryukova E.V., Novoseletsky V.N., Kazakov O.V., Orlov N.A., Korabeynikova V.N., Larina M.V., Fradkov A.F., Yakimov S.A., Kirpichnikov M.P., Feofanov A.V., Nekrasova O.V. New high-affinity peptide ligands for Kv1.2 channel: Selective blockers and fluorescent probes. Cells. 2024;13(24):2096.

16. Orlov N.A., Kryukova E.V., Efremenko A.V., Yakimov S.A., Toporova V.A., Kirpichnikov M.P., Nekrasova O.V., Feofanov A.V. Interactions of the Kv1. 1 channel with peptide pore blockers: a fluorescent analysis on mammalian cells. Membranes. 2023;13(7):645.

17. Porta E.A. Pigments in aging: An overview. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2002;959(1):57–65.

18. Nekrasova O.V., Volyntseva A.D., Kudryashova K.S., Novoseletsky V.N., Lyapina E.A., Illarionova A.V., Yakimov S.A., Korolkova Yu.V., Shaitan K.V., Kirpichnikov M.P., Feofanov A.V. Complexes of peptide blockers with Kv1.6 pore domain: Molecular modeling and studies with KcsA-Kv1.6 channel. J. Neuroimmune Pharmacol. 2017;12(2):260–276.

19. Denisova K.R., Orlov N.A., Yakimov S.A., Kirpichnikov M.P., Feofanov A.V., Nekrasova O.V. Atto488-agitoxin 2—a fluorescent ligand with increased selectivity for Kv1.3 channel binding site. Bioengineering. 2022;9(7):295.

20. Jones H.M., Hamilton K.L., Papworth G.D., Syme C.A., Watkins S.C., Bradbury N.A., Devor D.C. Roleof the NH2 terminus in the assembly and trafficking of the intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel hIK1. J. Biol. Chem. 2004;279(15):15531–15540.

21. Lee C.H., MacKinnon R. Activation mechanism of a human SK-calmodulin channel complex elucidated by cryo-EM structures. Science. 2018;360(6388):508–513.

22. Balut C.M., Hamilton K.L., Devor D.C. Trafficking of intermediate (KCa3.1) and small (KCa2.x) conductance, Ca2+-activated K+ channels: a novel target for medicinal chemistry efforts? ChemMedChem. 2012;7(10):1741–1755.

23. Jiménez-Pérez L., Cidad P., Álvarez-Miguel I., Santos-Hipólito A., Torres-Merino R., Alonso E., de la Fuente M.Á., López-López J.R., Pérez-García M.T. Molecular determinants of Kv1.3 potassium channels-induced proliferation. J. Biol. Chem. 2016;291(7):3569–3580.

24. Spear J.M., Koborssy D.A., Schwartz A.B., Johnson A.J., Audhya A., Fadool D.A., Stagg S.M. Kv1.3 contains an alternative C-terminal ER exit motif and is recruited into COPII vesicles by Sec24a. BMC Biochem. 2015;16(1):16.

25. Vicente R., Escalada A., Villalonga N., Texidó L., Roura-Ferrer M., Martín-Satué M., López-Iglesias C., Soler C., Solsona C., Tamkun M.M., Felipe A. Association of Kv1.5 and Kv1.3 Contributes to the major voltagedependent K+ channel in macrophages. J. Biol. Chem. 2006;281(49):37675–37685.