Оценка связывания ингибиторов PARP в режиме реального времени на основе Ni-NTA-агарозных шариков

В исследовании была создана платформа для флуоресцентной микроскопии, которая позволяет в режиме реального времени визуализировать динамику взаимодействия лиганда с белками, помеченными His-tag, связывающимися с Ni2+ на NTA-агарозных шариках. Эта методология преодолевает критические ограничения традиционных методов, таких как поверхностный плазмонный резонанс или гель-электрофорез, за счет сохранения кинетики фазы раствора и обеспечения субминутного временного разрешения в физиологических буферах. Мы применили эту платформу для исследования действия ингибиторов в системе нуклеосом, которая является более физиологически подходящей моделью, чем свободная ДНК. Изучая взаимодействия PARP2 с нуклеосомами в присутствии и в отсутствие клинических ингибиторов (талазопариба и велипариба), а также реакцию поли(АДФ-рибозил)ирования в присутствии НАД+, мы смогли продемонстрировать прямое пространственное и временное разрешение динамики хроматин-белок. Практически неограниченная совместимость платформы с буферами, возможность мониторинга в режиме реального времени и устранение артефактов ковалентной иммобилизации обеспечивают новое понимание механизмов взаимодействия лекарственных средств и хроматина.

1. Luger K., Hansen J.C. Nucleosome and chromatin fiber dynamics. Curr. Opin. Struct. Biol. 2005;15(2):188–196.

2. Luger K., Dechassa M.L., Tremethick D.J. New insights into nucleosome and chromatin structure. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012;13(7):436–447.

3. Langelier M.F., Planck J.L., Roy S., Pascal J.M. Structural basis for DNA damage-dependent poly(ADP-ribosyl) ation by human PARP-1. Science. 2012;336(6082):728–732.

4. Lakowicz J.R. Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd ed. N.Y.: Springer; 2006. 954 pp.

5. Maluchenko N.V., Nilov D.K., Pushkarev S.V., Kotova E.Y., Gerasimova N.S., Kirpichnikov M.P., Langelier M.F., Pascal J.M., Akhtar M.S., Feofanov A.V., Studitsky V.M. Mechanisms of nucleosome reorganization by PARP1. Int. J. Mol. Sci. 2021;22(22):12127.

6. Maluchenko N., Saulina A., Geraskina O., Kotova E., Korovina A., Armeev G., Kirpichnikov M., Feofanov A., Studitsky V. Poly(ADP-ribose)polymerase 2 is zinc-dependent enzyme and nucleosome reorganizer. Cell. Mol. Life Sci. 2025;82(1):267.

7. Maluchenko N., Koshkina D., Korovina A., Studitsky V., Feofanov A. Interactions of PARP1 inhibitors with PARP1-nucleosome complexes. Cells. 2022;11(21):3343.

8. Hellman L.M., Fried M.G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2007;2(8):1849–1861.

9. Pascal J.M. The comings and goings of PARP-1 in response to DNA damage. DNA Repair (Amst). 2018;71:177–182.

10. Riccio AA, Cingolani G, Pascal JM. PARP-2 domain requirements for DNA damage-dependent activation and localization to sites of DNA damage. Nucleic Acids Res. 2016;44(4):1691–1702.

11. Murai J., Huang S.Y., Das B.B., Renaud A., Zhang Y., Doroshow J.H., Ji J., Takeda S., Pommier Y. Trapping of PARP1 and PARP2 by clinical PARP inhibitors. Cancer Res. 2012;72(21):5588–5599.

12. Krüger A., Bürkle A., Hauser K., Mangerich A. Real-time monitoring of PARP1-dependent PARylation by ATR-FTIR spectroscopy. Nat. Commun. 2020;11(1):2174.

13. Kurgina T.A., Anarbaev R.O., Sukhanova M.V., Lavrik O.I. A rapid fluorescent method for the real-time measurement of poly(ADP-ribose) polymerase 1 activity. Anal. Biochem. 2018;545:91–97.

14. Langelier M.F., Riccio A.A., Pascal J.M. PARP-2 and PARP-3 are selectively activated by 5′ phosphorylated DNA breaks through an allosteric regulatory mechanism shared with PARP-1. Nucleic Acids Res. 2014;42(12):7762–7775.

15. Luger K., Mäder A.W., Richmond R.K., Sargent D.F., Richmond T.J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 1997;389(6648):251–260.

16. Richmond T.J., Davey C.A. The structure of DNA in the nucleosome core. Nature. 2003;423(6936):145–150.

17. Luger K., Rechsteiner T.J., Richmond T.J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Chromatin. Methods in Enzymology, vol. 304. Eds. P.M. Wassarman and A.P. Wolffe. Academic Press; 1999:3–19.

18. Wasserberg D., Cabanas-Danés J., Prangsma J., O’Mahony S., Cazade P.A., Tromp E., Blum C., Thompson D., Huskens J., Subramaniam V., Jonkheijm P. Controlling protein surface orientation by strategic placement of His-tags. ACS Nano. 2017;11(9):9350–9361.

19. Wu C.C., Reinhoudt D.N., Otto C., Velders A.H., Subramaniam V. Protein immobilization on Ni(II) ion patterns prepared by microcontact printing and dip-pen nanolithography. ACS Nano. 2010;4(2):1083–1091.

20. Castro-Hinojosa C., Del Sol-Fernández S., Moreno-Antolín E., Martín-Gracia B., Ovejero J.G., de la Fuente J.M., Grazú V., Fratila R.M., Moros M. A simple and versatile strategy for oriented immobilization of Histagged proteins on magnetic nanoparticles. Bioconjug. Chem. 2023;34(12):2275–2292.

21. Zandarashvili L., Langelier M.F., Velagapudi U.K., Hancock M.A., Steffen J.D., Billur R., Hannan Z.M., Wicks A.J., Krastev D.B., Pettitt S.J., Lord C.J., Talele T.T., Pascal J.M., Black B.E. Structural basis for allosteric PARP-1 retention on DNA breaks. Science. 2020;368(6486):eaax6367.

22. Lobanova A.A., Korovina A.N., Koshkina D.O., Chernikova P.A., Feofanov A.V., Studitsky V.M., Nilov D.K., Maluchenko N.V. Gel electrophoresis as a method for classifying inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerases 1 and 2. Mosc. Univ. Biol. Sci. Bull. 2024;79(4):239–245.

23. Langelier M.F., Steffen J.D., Riccio A.A., McCauley M., Pascal J.M. Purification of DNA damage-dependent PARPs from E. coli for structural and biochemical analysis. Poly(ADP-Ribose) Polymerase. Methods in Molecular Biology, vol 1608. N.Y.: Humana Press; 2017:431–444.

24. Koshkina D., Maluchenko N., Nilov D., Lyubitelev A., Korovina A., Pushkarev S., Armeev G., Kirpichnikov M., Studitsky V., Feofanov A. Non-classical H1-like PARP1 binding to chromatosome. Cells. 2025;14(17):1309.