Структура коллагенового матрикса мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток пупочного канатика: влияние условий культивирования

Внеклеточный матрикс (ВКМ), синтезируемый мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (МСК), играет ключевую роль в регуляции клеточного микроокружения и используется в разработке биоматериалов для регенеративной медицины. В настоящей работе проведена оценка влияния факторов, определяющих продукцию ВКМ, на геометрические параметры, структуру и продукцию коллагеновых волокон МСК из ткани пупочного канатика человека (МСК-ТПК). Исследовано влияние покрытия культуральных поверхностей желатином, продолжительности культивирования, концентрации фетальной бычьей сыворотки, а также добавок, стимулирующих продукцию ВКМ, – 2-фосфо-L-аскорбата натрия и каррагинана – на структуру коллагенового каркаса ВКМ и относительное содержание коллагеновых белков. Оптимальные условия включали культивирование МСК-ТПК на желатиновом покрытии в течение 11 сут в среде α-MEM с 10% фетальной бычьей сывороткой и добавлением аскорбата (50 мкМ). Эти параметры обеспечивали высокую адгезию, сохранность и отсутствие отслоений клеточного пласта, а также формирование коллагеновой сети ВКМ. Морфометрический анализ показал, что коллагеновый каркас ВКМ, полученный в таких условиях, характеризуется равномерным распределением, увеличением сонаправленности и числа пересечений волокон, сниженной лакунарностью и выраженной анизотропностью структуры. Относительное содержание коллагеновых белков было значимо выше, чем при других вариантах культивирования. Полученные данные позволяют рекомендовать разработанный протокол как эффективную и воспроизводимую платформу для получения биомиметических ВКМ, пригодных для задач клеточной инженерии и тканевой терапии.

1. Андреева Е.Р., Матвеева Д.К., Жидкова О.В., Буравкова Л.Б. Внеклеточный матрикс как фактор ре­гуляции физиологического микроокружения клетки. Успехи физиол. наук. 2024;55(1):16–30.

2. Ratcliffe C.D.H., Sahgal P., Parachoniak C.A., Ivas­ka J., Park M. Regulation of cell migration and β1 integrin trafficking by the endosomal adaptor GGA3. Traffic. 2016;17(6):670–688.

3. McCarty J.H. αvβ8 integrin adhesion and signaling pathways in development, physiology and disease. J. Cell Sci. 2020;133(12):jcs239434.

4. Матвеева Д.К., Андреева Е.Р. Регуляторная ак­тивность децеллюляризированного матрикса мультипо­тентных мезенхимных стромальных клеток. Цитология, 2020;62(10):699–715.

5. Assunção M., Dehghan-Baniani D., Yiu C.H.K., Später T., Beyer S., Blocki A. Cell-derived extracellular ma­trix for tissue engineering and regenerative medicine. Front. Bioeng. Biotechnol. 2020;8:602009.

6. Hussey G.S., Dziki J.L., Badylak S.F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nat. Rev. Mater. 2018;3(7):159–173.

7. Романов Ю.А., Романов А.Ю. Ткани перина­тального происхождения: уникальный источник клеток для регенеративной медицины. Часть II. Пупочный ка­натик. Неонатология. 2018;6(3):54–73.

8. Hoshiba T., Chen G., Endo C., Maruyama H., Wakui M., Nemoto E., Kawazoe N., Tanaka M. Decellular­ized extracellular matrix as an in vitro model to study the comprehensive roles of the ECM in stem cell differentiation. Stem Cells Int. 2016;2016:6397820.

9. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper- Cortenbach I., Marini F., Krause D., Deans R., Keating A., Prockop Dj., Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells: the ISCT position statement. Cytotherapy. 2006;8(4):315–317.

10. Kochetova E.S., Matveeva D.K., Melik-Pa-shayev A.E., Andreeva E.R., Romanov Yu.A., Buravkova L.B. Selection of optimal protocol for decellularization of extracel­lular matrix of mesenchymal stromal cells of human umbilical cord tissue. Bull. Exp. Biol. Med. 2025;178(4):535–540.

11. Bredfeldt J.S., Liu Y., Pehlke C.A., Conklin M.W., Szulczewski J.M., Inman D.R., Keely P.J., Nowak R.D., Mackie T.R., Eliceiri K.W. Computational segmentation of collagen fibers from SHG images of breast cancer. J. Biomed. Opt. 2014;19(1):16007.

12. Rezakhaniha R., Agianniotis A., Schrauwen J.T.C., Griffa A., Sage D., Bouten C. V. C., van de Vosse F.N., Un­ser M., Stergiopulos N. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in arterial adventitia using confocal microscopy. Biomech. Model. Mechanobiol. 2012;11:461–473.

13. Wershof E., Park D., Barry D.J., Jenkins R.P., Rul­lan A., Wilkins A., Schlegelmilch K., Roxanis I., Anderson K.I., Bates P.A., Sahai E. A FIJI macro for quantifying pattern in extracellular matrix. Life Sci. Alliance. 2021;4(3):e202000880.

14. Ushakov R., Ratushnyy A., Buravkova L., Tolkuno­va E., Burova E. The decellularized cell-derived ECM en­hances the paracrine function of human MSCs. Int. J. Mol. Sci. 2024;25(4):2419.

15. Laperle A., Masters K.S., Palecek S.P. Influence of substrate composition on human embryonic stem cell differ­entiation and ECM production in embryoid bodies. Biotech­nol. Prog. 2014;31(1):212–219.

16. Balasubramaniam L., Doostmohammadi A., Saw T.B., Narayana G.H.N.S., Mueller R., Dang T., Tho-mas M., Gupta S., Sonam S., Yap A.S., Toyama Y., Mège R.M., Yeomans J.M., Ladoux B. Investigating the nature of active forces in tissues reveals how contractile cells can form extensile monolayers. Nat. Mater. 2021;20(8):1156–1166.

17. Szász C., Pap D., Szebeni B., Bokrossy P., Őrfi L., Szabó A.J., Vannay Á., Veres-Székely A. Optimization of Sirius Red-based microplate assay to investigate collagen production in vitro. Int. J. Mol. Sci. 2023;24(24):17435.

18. Bilgen B., Orsini E., Aaron R.K., Ciombor D.M. FBS suppresses TGF-β1-induced chondrogenesis in synovio­cyte pellet cultures while dexamethasone and dynamic stimuli are beneficial. J. Tissue Eng. Regen. Med. 2007;1(6):436–442.

19. Kumar P., Satyam A., Fan X., Collin E., Rochev Y., Rodriguez B.J., Gorelov A., Dillon S., Joshi L., Raghunath M., Pandit A., Zeugolis D.I. Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies. Sci. Rep. 2015;5:8729.

20. Yamauchi M., Terajima M., Shiiba M. Lysine hy­droxylation and cross-linking of collagen. Post-translational Modifications of Proteins. Methods in Molecular Biology, vol. 1934. Ed. C. Kannicht. Humana Press; 2019: 309–324.

21. Du S., Elliman S.J., Zeugoliset D.I., O’Brien T. Carrageenan as a macromolecular crowding agent in human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cell culture. Int. J. Biol. Macromol. 2023;251:126353.

22. Fok S.W., Gresham R.C.H., Ryan W., Osipov B., Bahney C., Leach J.K. Macromolecular crowding and de­cellularization method increase the growth factor binding potential of cell-secreted extracellular matrices. Front. Bio­eng. Biotechnol. 2023;11:1091157.

23. Satyam A., Kumar P., Fan X., Gorelov A., Ro­chev Y., Joshi L., Peinado H., Lyden D., Thomas B., Rodri­guez B., Raghunath M., Pandit A., Zeugolis D. Macromo­lecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: a paradigm shift in regenerative medicine. Adv. Mater. 2014;26(19):3024–3034.

24. Arslan E., Guler M.O., Tekinay A.B. Glycosamino­glycan-mimetic signals direct the osteo/chondrogenic diffe-rentiation of mesenchymal stem cells in a 3D peptide nano­fiber ECM mimetic environment. Biomacromolecules. 2016;17(4):1280–1291.

25. Frankowski H., Gu Y.-H., Heo J.H., Milner R., Del Zoppo G.J. Use of gel zymography to examine matrix metalloproteinase (gelatinase) expression in brain tissue or in primary glial cultures. Astrocytes. Methods in Molecular Bio-logy, vol 814. Ed. R. Milner. Humana Press; 2012: 221–233.

26. Hackett T.L., Vriesde N.R.T.F., Al-Fouadi M., Mostaco-Guidolin L., Maftoun D., Hsieh A., Coxson N., Usman K., Sin D.D., Booth S., Osei E.T. The role of the dynamic lung extracellular matrix environment on fibroblast morphology and inflammation. Cells. 2022;11(2):185.

27. Piersma B., Wouters O.Y., de Rond S., Boerse­ma M., Gjaltema R.A.F., Bank R.A. Ascorbic acid promotes a TGF-β1-induced myofibroblast phenotype switch. Physiol. Rep. 2017;5(17):e13324.

28. Xing H., Lee H., Luo L., Kyriakides T.R. Extracel­lular matrix-derived biomaterials in engineering cell func­tion. Biotechnol. Adv. 2019;42:107421.

29. Mangır N., Bullock A.J., Roman S., Osman N., Chapple C., MacNeil S. Production of ascorbic acid-releas­ing biomaterials for pelvic floor repair. Acta Biomater. 2015;29:188–197.

30. Bhoot H.R., Zamwar U.M., Chakole S., An­jankar A. Dietary sources, bioavailability and functions of ascorbic acid and its role in cold, healing and iron metabo­lism. Cureus. 2023;15(11):e49308.

31. Chiang C.-E., Fang Y.-Q., Ho C.-T., As­sunção M., Lin S.-J., Wang Y.-C., Blocki A., Huang C.-C. Bioactive decellularized ECM from 3D stem cell spheroids under macromolecular crowding. Adv. Healthc. Mater. 2021;10(11):e2100064.

32. Park S.-J., Lee K.W., Lim D.-S., Lee S. The sulfa-ted polysaccharide fucoidan stimulates osteogenic differenti­ation of human adipose-derived stem cells. Stem Cells Dev. 2012;21(12):2204–2211.

33. Wang L., Lee W., Oh J.Y., Cui Y.R., Ryu B., Jeon Y.J. Protective effect of sulfated polysaccharides from Hizikia fusiforme against UVB-induced skin damage by regu­lating NF-ΚB, AP-1, and MAPKs signaling pathways in vit­ro in human dermal fibroblasts. Mar. Drugs. 2018;16(7):239.