Оптимизация преципитации внеклеточных протеаз из культуральной жидкости мукоромицета Absidia spinosa

Внеклеточные протеазы микроорганизмов выполняют разнообразные физиологические функции и обладают широким спектром субстратов, вследствие чего они находят применение в различных областях хозяйственной деятельности человека. На сегодняшний день мукоромицеты как источник протеаз исследованы лишь поверхностно. Целью данной работы стало изучение протеолитической активности секретируемых ферментов недавно описанного продуцента Absidia spinosa 2337. Культуральная жидкость микромицета, полученная после культивирования в ранее подобранных оптимальных условиях, обладала высокой общей протеолитической активностью, а также плазминоподобной и урокиназной активностью, превышающей или сравнимой с таковой в культуральных жидкостях известных продуцентов фибринолитиков из рода Aspergillus. Ферментный препарат выделяли из культуральной жидкости методом осаждения сульфатом аммония, при этом для наиболее эффективной преципитации протеаз потребовалось насыщение раствора до 90–100%, в то время как для осаждения протеаз других микромицетов применяют растворы в более низкой концентрации. После удаления сульфата аммония в ферментных препаратах было обнаружено более девяти белков с желатиназной активностью с молекулярными массами от 15 до 135 кДа и выше. Дальнейшее изучение уникальных свойств протеаз Absidia spinosa может привести к разработке новых препаратов тромболитических и коллагенолитических ферментов для биотехнологии и медицины

1. Reichard U., Cole G.T., Hill T.W., Ruchel R., Monod M. Molecular characterization and influence on fungal development of ALP2, a novel serine proteinase from Aspergillus fumigatus. Int. J. Med. Microbiol. 2000;290(6):549–558.

2. Phadatare S.U., Srinivasan M.C., Deshpande V.V. Evidence for controlled autoproteolysis of alkaline protease. A mechanism for physiological regulation of conidial discharge in Conidiobolus coronatus. Eur. J. Biochem. 1992;205(2):679–686.

3. Podder S., Saha D., Ghosh T.C. Deciphering the intrinsic properties of fungal proteases in optimizing phytopathogenic interaction. Gene. 2019;711:143934.

4. Nascimento T.P., Sales A.E., Porto T.S., Costa R.M.P.B., Breydo L., Uversky V.N., Porto A.L.F., Converti A. Purification, biochemical, and structural characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Mucor subtilissimus UCP 1262. Bioprocess Biosyst. Eng. 2017;40(8):1209–1219.

5. Gomes J.E.G, Rosa I.Z., Nascimento T.C.E.D.S., Souza-Motta C.M., Gomes E., Boscolo M., Moreira K.A., Pintado M.M.E., da Silva R. Biochemical and thermodynamic characteristics of a new serine protease from Mucor subtilissimus URM 4133. Biotechnol. Rep. (Amst). 2020;28:e00552.

6. Ali U., Ibrahim Z. Production and some properties of fibrinolytic enzyme from Rhizomucor miehei (Cooney & Emerson) Schipper. J. Appl. Sci. Res. 2008;4:892–899.

7. Xiao-Lan L., Lian-Xiang D., Fu-Ping L., XiQun Z., Jing X. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Rhizopus chinensis 12. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005;67(2):209–214.

8. Zhang S., Wang Y., Zhang N., Sun Z., Shi Y., Cao X., Wang H. Purification and characterisation of a fibrinolytic enzyme from Rhizopus microsporus var. tuberosus. Food Technol. Biotechnol. 2015;53(2):243–248.

9. Cao Y., Alexandrova A.V., Piecková E., Osmolovskiy A.A. Screening of new producers of proteolytic enzymes among micromycetes of Mucoromycota. Microbiol. Biotechnol. Lett. 2025;53(1):48–56.

10. Osmolovskiy A.A., Kreyer V.G., Baranova N.A., Kurakov A.V., Egorov N.S. Production of extracellular proteinases (protein C activators in blood plasma) by the micromycete Aspergillus ochraceus during submerged and solid-state cultivation. Appl. Biochem. Microbiol. 2013;49(6):580–586.

11. Тиморшина С.Н., Попова Е.А., Галиакберова А.А., Очнева А.Г., Осмоловский А.А. Протеолитические ферменты микромицетов рода Aspergillus, гидролизующие фибриллярные белки, для биомедицины и биотехнологических процессов. Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16. Биол. 2022;77(3):195–200.

12. Zvonareva E.S., Osmolovskiy A.A., Kreier V.G., Baranova N.A., Kotova I.B., Egorov N.S. Production of proteinase with plasmin-like and prekallikrein activating activity by the micromycete Aspergillus terreus. Appl. Biochem. Microbiol. 2018;54(2):206–210.

13. Wingfield P. Protein precipitation using ammonium sulfate. Curr. Protoc. Protein Sci. 2001;Appendix 3:Appendix 3F. doi: 10.1002/0471140864.psa03fs13.

14. Hu Y., Yu D., Wang Z., Hou J., Tyagi R., Liang Y., Hu Y. Purification and characterization of a novel, highly potent fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis DC27 screened from Douchi, a traditional Chinese fermented soybean food. Sci. Rep. 2019;9(1):9235.

15. Surkova D., Lavrenova V., Klyagin S., Shestakova A., Osmolovsky A. Screening of proteases produced by Aspergillus micromycetes active against proteins of the hemostasis system. Curr. Med. Mycol. 2023;9(1);8–13.

16. Осмоловский А.А., Шестакова А.А., Суркова Д.Е., Лехотска Р., Пецкова Е. Изучение спектра активности новых штаммов микромицетов рода Aspergillus в отношении белков системы гемостаза. Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16. Биол. 2023;78(2);109–114.

17. Осмоловский А.А., Шаш Б., Александрова А.В., Баранова Н.А., Крейер В.Г. Оценка спектра протеолитической активности микромицетов рода Aspergillus по отношению к белкам системы гемостаза. Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16. Биол. 2022;77(2):138–144.

18. Shirasaka N., Naitou M., Okamura K., Fukuta Y., Terashita T., Kusuda M. Purification and characterization of a fibrinolytic protease from Aspergillus oryzae KSK-3. Mycoscience. 2012;53(5):354–364.

19. Ueda M., Kubo T., Miyatake K., Nakamura T. Purification and characterization of fibrinolytic alkaline protease from Fusarium sp. BLB. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007;74(2):331–338.

20. Wu B., Wu L., Chen D., Yang Z., Luo M. Purification and characterization of a novel fibrinolytic protease from Fusarium sp. CPCC 480097. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2009;36(3):451–459.

21. Tharwat N.A. Purification and biochemical characterization of fibrinolytic enzyme produced by thermophilic fungus Oidiodendron flavum. Biotechnol. 2006;5(2):160–165.

22. Li G., Liu X., Cong S., Deng Y., Zheng X. A novel serine protease with anticoagulant and fibrinolytic activities from the fruiting bodies of mushroom Agrocybe aegerita. Int. J. Biol. Macromol. 2021;168:631–639.

23. Kotb E., Helal G.E.D.A., Edries F.M. Screening for fibrinolytic filamentous fungi and enzymatic properties of the most potent producer, Aspergillus brasiliensis AUMC 9735. Biologia. 2015;70(12):1565–1574.

24. Chimbekujwo K.I., Ja’afaru M.I., Adeyemo O.M. Purification, characterization and optimization conditions of protease produced by Aspergillus brasiliensis strain BCW2. Sci. Afr. 2020;8(1):e00398.

25. Larcher G., Cimon B., Symoens F., Tronchin G., Chabasse D., Bouchara J.P. A 33 kDa serine proteinase from Scedosporium apiospermum. Biochem. J. 1996;315(Pt. 1):119–126.

26. Lee S.Y., Kim J.S., Kim J.E., Sapkota K., Shen M.H., Kim S., Chun H.S., Yoo J.C., Choi H.S., Kim M.K., Kim S.J. Purification and characterization of fibrinolytic enzyme from cultured mycelia of Armillaria mellea. Protein Expr. Purif. 2005;43(1):10–17.

27. Kumaran S., Palani P., Nishanthi R., Kaviyarasan V. Studies on screening, isolation and purification of a fibrinolytic protease from an isolate (VK12) of Ganoderma Lucidum and evaluation of its antithrombotic activity. Med. Mycol. J. 2011;52(2):153–162.