ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ УСТАНОВКА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ОДИНОЧНЫХ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НУКЛЕОСОМ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ ПОЛНОГО ВНУТРЕННЕГО ОТРАЖЕНИЯ

Создана экспериментальная установка для изучения иммобилизованных молекул и их комплексов in vitro методом флуоресцентной микроскопии с чувствительностью на уровне одиночных флуорофоров. Установка регистрирует флуоресцентные изображения иммобилизованных молекул одновременно в двух спектральных диапазонах, обеспечивая анализ на основе эффекта Фёрстеровского резонансного переноса энергии. Возбуждение флуоресценции поверхностной световой волной, сформированной методом полного внутреннего отражения, и регистрация сигнала с помощью высокочувствительной системы детекции позволяют проводить измерения с временным разрешением около 100 мс. Разработан протокол модификации поверхности стекол для иммобилизации нуклеосом через высокоаффинные стрептавидин-биотиновые взаимодействия. Чтобы обеспечить иммобилизацию, один из концов ДНК флуоресцентно-меченых мононуклеосом был биотинилирован. Разработан алгоритм обработки изображений для анализа структурных перестроек в одиночных нуклеосомах. Флуоресцентная микроскопия одиночных иммобилизованных молекул и их комплексов расширяет возможности изучения структурной динамики нуклеосом при транскрипции и взаимодействии с различными ядерными белками.

1. Sustarsic M., Kapanidis A.N. Taking the ruler to the jungle: single-molecule FRET for understanding biomolecular structure and dynamics in live cells // Curr. Opin. Struct. Biol. 2015. Vol. 34. P. 52–59.

2. Juette M.F., Terry D.S., Wasserman M.R., Zhou Z., Altman R.B., Zheng Q., Blanchard S.C. The bright future of single-molecule fluorescence imaging // Curr. Opin. Chem. Biol. 2014. Vol. 20. P. 103–111.

3. Luo Y., North J.A., Poirier M.G. Single molecule fluorescence methodologies for investigating transcription factor binding kinetics to nucleosomes and DNA // Methods. 2014. Vol.70. N 2–3. P. 108–118.

4. Ngo T.T., Ha T. Nucleosomes undergo slow spontaneous gaping // Nucleic Acids Res. 2015. Vol. 43. N 8. P. 3964–3971.

5. Ngo T.T., Zhang Q., Zhou R., Yodh J.G., Ha T. Asymmetric unwrapping of nucleosomes under tension directed by DNA local flexibility // Cell. 2015. Vol. 160. N 6. P. 1135–1144.

6. Kudryashova K.S., Chertkov O.V., Nikitin D.V., Pestov N.A., Kulaeva O.I., Efremenko A.V., Solonin A.S., Kirpichnikov M.P., Studitsky V.M., Feofanov A.V. Preparation of mononucleosomal templates for analysis of transcription with RNA polymerase using spFRET // Methods Mol. Biol. 2015. Vol. 1288. P. 395–412.

7. Feofanov A.V., Kudryashova K.S., Chertkov O.V., Nikitin D.V., Pestov N.A., Kulaeva O.I., Studitsky V.M., Kirpichnikov M.P. Analysis of nucleosome transcription using singleparticle FRET // Springer Proc. Phys. 2015. Vol. 164. P. 255–260.

8. Kudryashova K.S., Nikitin D.V., Chertkov O.V., Gerasimova N.S.,Valieva M.E., Studitsky V.M., Feofanov A.V. Development of fluorescently labeled mononucleosomes for the investigation of transcription mechanisms by single complex microscopy // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2015. Vol. 70. N 4. P. 189–193.