ОЧИСТКА ЭЛОНГАЦИОННЫХ КОМПЛЕКСОВ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕТОДОМ КРИОЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
Аннотация
Разработана методика подготовки образца остановленного элонгационного комплекса РНК-полимеразы Escherichia coli с нуклеосомой для исследования с помощью криоэлектронной микроскопии. Разработана методика очистки комплекса от избытка свободной РНК-полимеразы и непродуктивных комплексов на гепариновой смоле. Для концентрирования элонгационного комплекса был применен аффинный монослой, сформированный липидами, связанными с ионами Ni. Применение подготовленных аффинных сеток с иммобилизированным монослоем липидов позволило предотвратить агрегацию частиц комплекса на поверхности сетки. Разработанная методика может применяться для получения трехмерной реконструкции элонгационного комплекса ЕС+39.
Ключевые слова
РНК-полимераза,
нуклеосома,
элонгационный комплекс,
аффинная сетка,
очистка белка,
электронная микроскопия
При поддержке: РНФ
Об авторах
О. В. Чертков
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова
Россия
Россия
канд. биол. наук, вед. инж. кафедры биоинженерии биологического факультета,
119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12
М. Г. Карлова
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова
Россия
Россия
мл. науч. сотр. кафедры биоинженерии биологического факультета,
119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12
Н. С. Герасимова
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова
Россия
Россия
канд. биол. наук, асс. кафедры биоинженерии биологического факультета,
119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12
О. С. Соколова
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова
Россия
Россия
докт. биол. наук, проф. кафедры биоинженерии биологического факультета,
119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12
Список литературы
1. Dion M.F., Kaplan T., Kim M., Buratowski S., Friedman N., Rando O.J. Dynamics of replication-independent histone turnover in budding yeast // Science. 2007. Vol. 315. N 5817. P. 1405–1408.
2. Kireeva M.L., Walter W., Tchernajenko V., Bondarenko V., Kashlev M., Studitsky V.M. Nucleosome remodeling induced by RNA polymerase II: loss of the H2A/H2B dimer during transcription // Mol. Cell. 2002. Vol. 9. N. 3. P. 541–552.
3. Gaykalova D.A., Kulaeva O.I., Volokh O., Shaytan A.K., Hsieh F.K., Kirpichnikov M.P., Sokolova O.S., Studitsky V.M. Structural analysis of nucleosomal barrier to transcription // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015. Vol. 112. N. 43. P. 5787– 5795.
4. Pestov N.A., Gerasimova N.S., Kulaeva O.I., Studitsky V.M. Structure of transcribed chromatin is a sensor of DNA damage // Sci. Adv. 2015. Vol. 1. N. 6. e1500021.
5. Kulaeva O.I., Gaykalova D.A., Pestov N.A., Golovastov V.V., Vassylyev D.G., Artsimovitch I., Studitsky V.M. Mechanism of chromatin remodeling and recovery during passage of RNA polymerase II // Nat. Struct. Mol. Biol. 2009. Vol. 16. N 12. P. 1272–1278.
6. Murakami K.S., Darst S.A. Bacterial RNA polymerases: the wholo story // Curr. Opin. Struct. Biol. 2003. Vol. 13. P. 31–39.
7. Luger K., M der A. W., Richmond R. K., Sargent D. F., Richmond T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution // Nature. 1997. Vol. 389. N 6648. P. 251–260.
8. Kudryashova K.S., Nikitin D.V., Chertkov O.V., Gerasimova N.S., Valieva M.E. Studitsky V.M., Feofanov A.V. Development of fluorescently labeled mononucleosomes for the investigation of transcription mechanisms by single complex microscopy // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2015. Vol. 70. N 4. P. 189–193.
9. Karlova M.G., Volokh O.I., Chertkov O.V., Kirpichnikov M.P., Studitsky V.M., Sokolova O.S. Purification and concentration of RNA polymerase on Ni-lipid monolayers // Russ. J. Bioorg. Chem. 2017. Vol. 43. N 6. P. 637–643.
10. Gaykalova D.A., Kulaeva O.I., Bondarenko V.A., Studitsky V.M. Preparation and analysis of uniquely positioned mononucleosomes // Methods in Molecular Biology. Vol. 523. Chromatin Protocols / S.P. Chellappan. Humana Press, 2009. P. 109–123.
11. Kelly D.F., Abeyrathne P.D., Dukovski D., Walz T. The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification // J. Mol. Biol. 2008. Vol. 382. N 2. P. 423–433.
12. Walter W., Kireeva M.L., Studitsky V.M., Kashlev M. Bacterial polymerase and yeast polymerase II use similar mechanisms for transcription through nucleosomes // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. N. 38. P. 36148–36156.
Рецензия
Для цитирования:
Чертков О.В., Карлова М.Г., Герасимова Н.С., Соколова О.С. ОЧИСТКА ЭЛОНГАЦИОННЫХ КОМПЛЕКСОВ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕТОДОМ КРИОЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ. Вестник Московского университета. Серия 16. Биология. 2018;73(3):173-177.
For citation:
Chertkov O.V., Karlova M.G., Gerasimova N.S., Sokolova O.S. PURIFICATION OF RNA-POLYMERASE ELONGATION COMPLEXES FOR CRYOELECTRON MICROSCOPY INVESTIGATION. Vestnik Moskovskogo universiteta. Seriya 16. Biologiya. 2018;73(3):173-177. (In Russ.)
Просмотров:
299
Послать статью по эл. почте 