Некоторые особенности применения методов денатурационной и безденатурационной гибридизации in situ при изучении хромосом злаков

Безденатурационная флуоресцентная гибридизация in situ (ND-FISH) — удобный метод цитогенетических исследований. По сравнению со стандартной методикой ND-FISH отличается скоростью и простотой исполнения, требует меньше времени, реактивов и приборной базы, поэтому набирает все большую популярность у разных групп ученых и используется для решения разнообразных научных задач. Однако при использовании данного метода для изучения хромосом злаков мы столкнулись с некоторыми особенностями его применения в сочетании с олигонуклеотидными пробами. В данной работе мы сравнили три модификации: два разных варианта денатурационного метода и безденатурационной FISH. В общепринятой методике FISH для растений и ее модификациях хромосомы подвергаются обработке с добавлением формамида при высокой температуре, в результате чего происходит денатурация сверхспи-рализованной ДНК хромосом растений. В методике безденатурационной FISH этот этап опущен, что позволяет сохранить структуру хромосом, экономит время и ресурсы. В нашей работе все методики показали свою эффективность. Безденатурационная ND-FISH отличается простотой и удобством, однако меньшей воспроизводимостью в ряде экспериментов. Стандартный метод и его модификация наиболее стабильны и надежны, но могут негативно сказываться на морфологии хромосом. При последовательных гибридизациях с использованием тех же препаратов (sequential FISH) мы рекомендуем сочетание данных методов — с первичным проведением FISH по стандартному протоколу и последующими гибридизациями методом ND-FISH.

1. Rosato M, Alvarez I, Nieto Feliner G., Rossello J.A. High and uneven levels of 45S rDNA site-number variation across wild populations of a diploid plant genus (Anacyclus, Asteraceae) // PLoS ONE. 2017. Vol. 12. N 10: e0187131.

2. Han F.P., Lamb J.C., Birchler J.A. High frequency of centromere inactivation resulting in stable dicentric chromosomes of maize // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2006. Vol. 103. N 9. P. 3238-3243.

3. Tang Z.X., Yang Z.J., Fu S.L Oligonucleotides replacing the roles of repetitive sequences pAs1, pSc119.2, pTa-535, pTa71, CCS1, and pAWRC.1 for FISH analysis // J. Appl. Genet. 2014. Vol. 55. N 3. P. 313-318.

4. Fu S.L., Chen L, Wang Y.Y., Li M, YangZ.J., Qiu L., Yan B.J., Ren Z.L., Tang Z.X Oligonucleotide probes for ND-D-FISH analysis to identify rye and wheat chromosomes // Sci. Rep. 2015. Vol. 5: 10552.

5. Xiao Z, Tang S, Qiu L, Tang Z, Fu S. Oligonucleotides and ND-FISH displaying different arrangements of tandem repeats and identification of Dasypyrum villosum chromosomes in wheat backgrounds // Molecules. 2017. Vol. 22. N 6: 973.

6. Badaeva E.D., Amosova A.V., Goncharov N.P., Macas J., Ruban A.S., Grechishnikova I.V., Zoshchuk S.A., Houben A. A set of cytogenetic markers allows the precise identification of all A-genome chromosomes in diploid and polyploidy wheat // Cytogenet. Genome Res. 2015. Vol. 146. N 1. P. 71-79.

7. Li G.R., Gao D, Zhang H.G., Li J.B., Wang H.J., La S.X., Ma J. W, YangZJ. Molecular cytogenetic characterization of Dasypyrum breviaristatum chromosomes in wheat background revealing the genomic divergence between Dasypyrum species // Mol. Cytogenet. 2016. Vol. 9. N 1: 6.

8. Du P, Zhuang L.F., Wang Y.Z., Yuan Q, Wang D.R., Dawadondup, Tan L.J., Shen J., Xu H.B., Zhao H. Development of oligonucleotides and multiplex probes for quick and accurate identification of wheat and Thinopyrum bessarabicum chromosomes // Genome. 2017. Vol. 60. N 2. P. 93-103.

9. Puterova J., Razumova O, Martinek T, Alexandrov O, Divashuk M, Kubat Z, Hobza R, Karlov G, Kejnovsky E. Satellite DNA and transposable elements in seabuckthorn (Hippophae rhamnoides), a dioecious plant with small Y and large X chromosomes // Genome Biol. Evol. 2017. Vol. 9. N 1. P. 197-212.

10. Xin H, Zhang T, Han Y., Wu Y., Shi J., Xi M, Jiang J. Chromosome painting and comparative physical mapping of the sex chromosomes in Populus tomentosa and Populus deltoides // Chromosoma. 2018. Vol. 127. N 3. P. 313-321.

11. Tang S, Tang Z, Qiu L, Yang Z, Li G, Lang T, Zhu W, Zhang J, Fu S. Developing new Oligo probes to distinguish specific chromosomal segments and the A, B, D genomes of wheat (Triticum aestivum L.) using ND-FISH // Front. Plant Sci. 2018. Vol. 9: 1104.

12. Jiang M, Xaio Z.Q., Fu S.L., Tang ZX. FISH karyotype of 85 common wheat cultivars/ lines displayed by ND-FISH using oligonucleotide probes // Cereal Res. Commun. 2017. Vol. 45. N 4. P. 549-563.

13. Kirov I.V., Kiseleva A.V., Van Laere K., Van Roy N, Khrustaleva L.I. Tandem repeats of Allium fistulosum associated with major chromosomal landmarks // Mol. Genet. Genomics. 2017. Vol. 292. N 2. P. 453-464.

14. Alexandrov O.S., Karlov G.I. Molecular cytogenetic analysis and genomic organization of major DNA repeats in castor bean (Ricinus communis L.) // Mol. Genet. Genomics. 2016. Vol. 291. N 2. P. 775-787.

15. Komuro S, Endo R, Shikata K, and A. Kato. Genomic and chromosomal distribution patterns of various repeated DNA sequences in wheat revealed by a fluorescence in situ hybridization procedure // Genome. 2013. Vol. 56. N 3. P. 131-137.

16. Kato A. High-density fluorescence in situ hybridization signal detection on barley (Hordeum vulgare L.) chromosomes with improved probe screening and reprobing procedures // Genome. 2011. Vol. 54. N 2. P. 151-159.

17. Iwata-Otsubo A., Radke B., Findley S, Abernathy B., Vallejos C.E., Jackson S.A. Fluorescence in situ hybridization (FISH)-based karyotyping reveals rapid evolution of centromeric and subtelomeric repeats in common bean (Phaseolus vulgaris) and relatives // G3: Genes, Genom., Genet. 2016. Vol. 6. N 4. P. 1013-1022.

18. Badaeva E.D., Ruban A.S. Evolution of the S-genomes in Triticum-Аegilops alliance: evidences from chromosome analysis // Front. Plant Sci. 2018. Vol. 9: 1756.

19. Badaeva E.D., Ruban A.S., Aliyeva-Schnorr L, Municio C, Hesse S, Houben A. In situ hybridization to plant chromosomes // Fluorescence in situ hybridization (FISH). Springer Protocols Handbooks / Ed. T. Liehr. Berlin, Heidelberg: Springer, 2017. Р. 477-494.

20. Lang T, Li G, Wang H, Yu Z, Chen Q, Yang E, Fu S, Tang Z, Yang Z. Physical location of tandem repeats in the wheat genome and application for chromosome identification // Planta. 2018. Vol. 249. N 3. P. 663-675.