В обзоре отражена история появления и усовершенствования клеточных моделей и различных способов и систем культивирования клеток животных и человека для исследований биологической активности различных веществ in vitro. Культуры органов и традиционные двухмерные культуры диссоциированных клеток различных типов, таких как первичные, опухолевые, индуцированные плюрипотентные, стволовые и другие, имеют преимущества и недостатки, однако зачастую не являются адекватными моделями для изучения биологических процессов, происходящих в живых организмах. В настоящее время на ранних фазах разработки лекарственных препаратов для отбора наиболее активных соединений и оценки их цитотоксического действия широко используется высокопроизводительный клеточный скрининг с применением различных способов детекции сигнала: оптических на основе колориметричесих, люминесцентных и флуоресцентных методов и электрохимических. Использование животных в качестве моделей для тестирования препаратов все больше подвергается критике из-за низкой степени корреляции между результатами, получаемыми в исследованиях с их использованием, и результатами, получаемыми на человеке, а также из-за дороговизны и этических вопросов. Поэтому много усилий направлено на создание моделей на основе клеток человека. Так появились культуры c трехмерным каркасом для имитации архитектуры тканей in vivo, а затем и микроинженерные конструкции на основе законов микрогидродинамики, объединяющие несколько типов клеток, так называемые “органы-на-чипах”, позволяющие воссоздавать физические и химические параметры микроокружения клеток в естественных условиях. Таким образом, экспериментальные клеточные системы с момента появления прошли путь от культивируемых в питательной среде целых органов до практически полной реконструкции органов in vitro с использованием различных типов клеток и передовых инженерных решений, что позволяет в настоящее время воссоздавать in vitro сложные биологические процессы и более успешно изучать влияние на них различных химических веществ и физических факторов.

Ротавирусная инфекция – инфекционное заболевание, вызванное ротавирусами. Она является главной причиной тяжелых диарей у детей во всем мире и одним из факторов, определяющих детскую смертность. В настоящее время для вакцинации против ротавирусной инфекции используются только живые ослабленные (аттенуированные) вакцины. Данные вакцины эффективны, но обладают рядом побочных действий, прежде всего, риском возникновения инвагинации кишечника. Осложнения при применении существующих вакцин, как правило, связаны с пероральным введением препаратов и возникают в результате размножения ослабленных живых вакцин в кишечнике человека. В связи с этим, существует необходимость создания современных, эффективных и безопасных препаратов для борьбы с ротавирусной инфекцией, не способных размножаться (реплицироваться) в организме вакцинируемого. В последние годы стали активно разрабатываться и испытываться вакцины нового поколения против ротавирусной инфекции – рекомбинантные вакцины, в том числе, парентерального введения. При этом одной из проблем при создании таких вакцин является сложная антигенная структура ротавируса. В данном обзоре представлен анализ литературы о генетическом и антигенном разнообразии штаммов ротавирусов и географической локализации их эпидемически значимых вариантов. Обсуждаются роль капсидных белков в формировании иммунного ответа на вирус и современное состояние разработок новых кандидатных рекомбинантных вакцин против ротавирусной инфекции.

Изучение возможностей модификации и структурной перестройки вирионов и вирусных белков – важная задача современной молекулярной вирусологии. Ранее в нашей лаборатории был разработан метод термической обработки палочковидного вируса табачной мозаики, позволяющий получить структурно модифицированные частицы сферической формы, состоящие из вирусного белка оболочки. Такие частицы обладали уникальными адсорбционными и иммуногенными свойствами и были успешно нами использованы для создания новой кандидатной вакцины против вируса краснухи. Позднее мы продемонстрировали возможность термической перестройки нитевидных вирионов Х-вируса картофеля. Настоящая работа посвящена сравнительному изучению термической перестройки вирусов с различной структурой, относящихся к разным таксономическим группам. Показано образование структурно модифицированных частиц сферической формы при термической обработке палочковидных вирионов со спиральным типом симметрии (вирус мозаики долихоса, вирус штриховатой мозаики ячменя). Выявлена зависимость размеров сферических частиц, образующихся из вируса мозаики долихоса, от исходной концентрации вируса. Изучена возможность термической перестройки нитевидных вирионов и вирусоподобных частиц вируса мозаики альтернантеры. При термической обработке вирусов растений с икосаэдрическим типом симметрии морфологических изменений обнаружено не было.

Биоиндикаторами состояния водных систем могут служить различные характеристики сообществ фитопланктона. Для создания модели природной экосистемы, которая позволит проводить многофакторные эксперименты по влиянию физико-химических факторов на биофизические и гидробиологические характеристики фитопланктона, необходим подбор соответствующих видов микроводорослей. Проведенное исследование позволило из имеющихся в музее видов выбрать шесть для создания модельного альгоценоза. Было установлено, что для оптимального роста всех этих видов необходимы схожие условия эксперимента (световой и температурный режимы, содержание элементов питания). В качестве базовой среды предложено использовать среду с пониженным содержанием азота. В таких условиях клетки микроводорослей нормально функционируют и делятся, при этом длительность достижения стационарной стадии роста (10–15 сут), на которой завершают эксперимент, позволяет проводить большое число таких экспериментов с минимальными затратами времени. Клетки отобранных видов обладают морфологическими различиями, достаточными для автоматизированной идентификации их в поликультуре. Получены геометрические характеристики клеток для компьютерного подсчета численности каждого вида сообщества по микрофотографиям.

Использование тканеинженерных конструкций на основе скаффолдов, имитирующих внеклеточный матрикс живой ткани, открывает новые возможности в лечении различных патологий и травм, связанных с повреждениями тканей и органов. Фиброин шёлка тутового шелкопряда Bombyx mori является биосовместимым, биорезорбируемым полимером, обладающим высокой механической прочностью и эластичностью, что позволяет создавать на его основе скаффолды для регенерации различных тканей, в том числе костной. В представленной работе были получены фиброиновые скаффолды в виде пористых губок, плёнок и гибридных скаффолдов, представляющих из себя бислойные конструкции, в которых трёхмерная структура, свойственная скаффолдам в виде губки, ограничена с одной стороны плёнкой. Были исследованы структура скаффолдов и их биосовместимость: показано, что иммортализованные и первичные фибробласты, а также остеобластоподобные клетки успешно прикрепляются к поверхности исследованных скаффолдов и пролиферируют на ней. В экспериментах in vivo на модели дефекта бедренной кости крысы через четыре недели после имплантации пористого фиброинового скаффолда в области имплантата наблюдались многочисленные очаги остеогенеза, что свидетельствует об остеокондукции скаффолдов.

На основе эффекта Фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET) разработана методика анализа структуры (Су3, Су5)-меченных нуклеосом в полиакриламидном геле после электрофореза в нативных условиях. Показано, что корректное применение этой методики требует контроля за неспецифическим межмолекулярным FRET и перепоглощением флуоресценции. Проведен сравнительный анализ результатов FRET-измерений двух типов нуклеосом и их комплексов с дрожжевым белком FACT, который подтвердил сходство структурных особенностей нуклеосом, выявляемых в геле и в водном растворе. Применение FRET-анализа в комбинации с электрофорезом позволяет не только разделить и визуализировать компоненты сложной смеси, оценив их относительное содержание, но и охарактеризовать структурные отличия этих компонентов in situ.

Описан новый штамм-деструктор фенола и 2,4-дихлорфенола (2,4-ДХФ), Rhodococcus erythropolis 17S, выделенный из почвы химического предприятия, имеющего длительную историю контакта с фенолом и его производными. Идентификация штамма проведена с учетом морфометрических, культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков, а также результатов сравнительного анализа последовательности гена 16S рРНК. Исследован рост периодической культуры R. erythropolis 17S в условиях использования фенола и 2,4-ДХФ в качестве источников углерода и энергии. Содержание фенола в культуральной жидкости снижалось к 4-м сут на 55%, а 2,4-ДХФ – к 22-м сут на 47% от контроля. Выявлена возможность применения R. erythropolis 17S для утилизации фенола в промышленных стоках нефтехимического производства и производства дубильных экстрактов.

Показано, что микромицеты Aspergillus ustus 1 и Tolypocladium inflatum k1 секретируют протеолитические ферменты, обладающие высокой коллагенолитической, фибринолитической и эластолитической активностью. Активность протеиназ, гидролизующих фибриллярные белки, определяемая по расщеплению азоколлагена, у T. inflatum k1 составила 122,6•10–3 ЕАзк/мл у A.ustus 1 и 69,7•10–3 ЕАзк/мл (ЕАзк – количество расщепившегося за 1 мин азоколлагена в микрограммах). Максимальные значения активности наблюдались при культивировании в глубинных условиях A. ustus 1 в течение 4 сут, а T. inflatum k1 – в течение 5 сут. Показано, что максимумы проявления коллагенолитической и общей протеолитической активности при культивировании у A. ustus 1, в отличие от T. inflatum k1, разнесены во времени, что, предположительно, может упростить процедуру получения активных по отношению к фибриллярным белкам протеиназ.

Многие вторичные метаболиты бактерий, включая перспективные в фармакологическом отношении, синтезируются с помощью ферментных комплексов поликетидсинтаз (PKS). В работе определены нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК и PKS у штаммов гетеротрофных бактерий, выделенных из эпилитических биопленок, сформированных в литоральной зоне озера Байкал. По результатам молекулярно-филогенетического анализа генов 16S рРНК установлена следующая таксономическая принадлежность изолированных штаммов: Serratia fonticola 1А и 10А, Pseudomonas umsongensis K10-2 и K10-3, Rheinheimera tilapiae K18 и Flavobacterium sp. 43-09. У исследуемых штаммов определены 33 последовательности фрагментов генов, кодирующих PKS. Среди гомологичных нуклеотидных последовательностей обнаружены гены, ответственные за биосинтез антибиотиков (диффицидина, эритромицина, курацина, миксаламида, кораллопиронина, миксатиазола) и цитостатиков (ромидепсина, спирухостатина, дисоразола). Невысокое сходство (50–83%) аминокислотных последовательностей PKS байкальских бактерий с опубликованными в GenBank последовательностями свидетельствует об их потенциальной способности продуцировать новые, до настоящего времени неизвестные, биоактивные соединения. Полученные результаты показывают, что исследуемые штаммы могут представлять практический интерес для биотехнологии.

Nhp6 – это небольшой белок дрожжей, неспецифично связывающий ДНК. Ранее было показано, что Nhp6 входит в состав нескольких комплексов (в том числе комплекса FACT), присутствует на многих дрожжевых промоторах и транскрибируемых участках генов in vivo и участвует в процессе дестабилизации структуры нуклеосом in vitro. В нашей лаборатории был изучен фактор FACT и показана его роль в трaнскрипции хроматина эукариотической РНК-полимеразой 2 in vitro, однако роль белка Nhp6 в транскрипции ранее не была исследована. В данной работе мы изучили влияние этого белка на транскрипцию нуклеосом эукариотической РНК-полимеразой 2 и показали, что он увеличивает эффективность транскрипции в нескольких положениях на нуклеосомной ДНК, в первую очередь – участка в положении +(11–17) в нуклеосоме. Предложена модель действия Nhp6, предполагающая стабилизацию транзитного отворачивания ДНК от октамера гистонов в процессе транскрипции хроматина.

Кратко рассматриваются представления сторонников и противников запрограммированности старения о целесообразности этого явления для эволюции живых организмов. Мы полагаем, что у эволюции нет никакой “геронтологической” цели, ибо обязательное ограничение клеточной пролиферации в процессе развития многоклеточных организмов является фактором, “автоматически” запускающим старение из-за накопления в клетках различных макромолекулярных повреждений вследствие торможения или даже полного прекращения возникновения новых, неповрежденных, клеток. Это ведет к подавлению “разбавления” стохастических повреждений (наиболее важными из которых являются повреждения ДНК) на уровне всей клеточной популяции. Перечисляются также некоторые дополнительные доводы в пользу нецелесообразности старения как для вида, так и для индивида.

Некоторые виды цианобактерий способны продуцировать токсины, концентрация которых в период цветения воды может достигать величины, опасной для жизни человека и животных. Планктонные цианобактерии являются наиболее распространенными и изученными продуцентами микроцистинов – циклических гептапептидов, вызывающих поражения печени, менее известны микроцистин-синтезирующие бентосные цианобактерии. В озере Байкал в последние годы зарегистрировано массовое развитие бентосных цианобактерий, формирующих обширные обрастания на различных субстратах. В обрастаниях природных и искусственных субстратов, отобранных в прибрежной зоне озера Байкал, в том числе на больных и погибших эндемичных губках Lubomirskia baicalensis и Baikalospongia spp., выявлены микроцистины, продуцируемые бентосными цианобактериями. С применением микроскопии показано, что в составе обрастаний преобладают ностоковые и осцилляториевые цианобактерии с доминированием Tolypothrix distorta – потенциального продуцента микроцистинов. Концентрация микроцистинов в биопленках по данным иммуноферментного анализа составила 29,8–3050 мкг/кг сухого веса. Методом масс-спектрометрии MALDI-TOF/TOF идентифицировано восемь вариантов микроцистинов, из которых наиболее часто встречался вариант [Dha7]MC-YR. В биопленках, образованных на искусственном субстрате видом Phormidium autumnale, также выявлено присутствие микроцистинов. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости регулярного мониторинга потенциально токсичных видов и содержания цианотоксинов в планктоне и бентосе прибрежной зоны озера Байкал, особенно в районах активной туристско-рекреационной деятельности.